Transsynaptische Tracing van Perifere Targets met pseudorabiësvirus Gevolgd door Cholera toxine en Gebiotinyleerde Dextran Amines Double Labeling
Summary
Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.
Abstract
Transsynaptische tracing is uitgegroeid tot een krachtig instrument dat wordt gebruikt om de centrale afferenten dat perifere doelen door middel van multi-synaptische circuits regelen analyseren. Deze benadering is het meest uitgebreid gebruikt in de hersenen door gebruikmaking van de varkens- pathogeen pseudorabies virus (PRV) 1. PRV niet infecteert mensapen, waaronder de mens, dus wordt het meest gebruikt in studies op kleine zoogdieren, vooral knaagdieren. De pseudorabiës stam PRV152 drukt de verbeterde groen fluorescerend eiwit (eGFP) reportergen en slechts kruist functionele synapsen retrogradely door de hiërarchische volgorde van de synaptische verbindingen weg van de plaats van infectie 2,3. Andere PRV stammen hebben verschillende microbiologische eigenschappen en kan in beide richtingen (PRV-Becker en PRV-Kaplan) 4,5 vervoerd worden. Dit protocol zal uitsluitend met PRV152. Door het leveren van het virus in een perifere locatie, zoals spieren, het mogelijk om de binnenkomst van het virus in t beperkenHij hersenen door middel van een specifieke set van neuronen. Het resulterende patroon van eGFP signaal over de hersenen oplost dan de neuronen die zijn verbonden met de oorspronkelijk geïnfecteerde cellen. Aangezien het gedistribueerde karakter van transsynaptische tracing met pseudorabiësvirus maakt interpreteren specifieke verbindingen binnen een geïdentificeerde netwerk moeilijk presenteren we een gevoelige en betrouwbare werkwijze gebruik gebiotinyleerd dextran amines (BDA) en choleratoxine subunit B (CTB) voor het bevestigen van de verbindingen tussen cellen geïdentificeerd met behulp PRV152. Immunochemische detectie van BDA en CTB met peroxidase en DAB (3, 3'-diaminobenzidine) werd gekozen omdat ze effectief blootleggen cellulaire processen, waaronder distale dendrieten 6-11.
Introduction
Transsynaptische tracing is uitgegroeid tot een krachtig instrument dat wordt gebruikt om de centrale afferenten dat perifere doelen door middel van multi-synaptische circuits regelen analyseren. Deze benadering is het meest uitgebreid gebruikt in de knaagdierhersenen door gebruikmaking van de varkens- pathogeen pseudorabies virus (PRV), vooral de verzwakte stam PRV-Bartha eerst beschreven in 1961 12. Hier presenteren we een protocol voor het identificeren van de motor corticale representatie van bepaalde spieren of spiergroepen met een recombinant pseudorabies virusstam (PRV152) die het versterkt groen fluorescent proteïne (eGFP) reportergen 2. De beschreven methode maakt gebruik van het gedrag van neurotrope virussen, die infectieus nageslacht dat kruis synapsen met andere neuronen besmetten binnen een functioneel circuit 3,4,13 produceren. PRV152, die isogeen met PRV-Bartha, maar kruist synapsen retrogradely door de hiërarchische volgorde van de synaptische verbindingen weg van de plaats van infectie 3,5 </ sup>. Door juist de perifere plaats van infectie beheersen is het mogelijk om de binnenkomst van het virus in de hersenen door middel van een specifieke subgroep van motorneuronen beperken. Omdat het virus infecteert achtereenvolgens ketens verbonden neuronen, zal het resulterende patroon van eGFP signaal over de hersenen dan het oplossen van de netwerk van neuronen die zijn aangesloten op de oorspronkelijk geïnfecteerde cellen.
Een bijkomend voordeel van het gebruik virus neurale tracing is de amplificatie van het reporter proteïne (eGFP in dit geval) in geïnfecteerde cellen. Deze signaalversterking biedt een niveau van gevoeligheid die de detectie van zelfs schaars projecties maakt. Bijvoorbeeld, een dun uitsteeksel van vibrissa motorische cortex het gezicht motorneuronen regelen van de whiskers werd gevonden in ratten middels viraal tot expressie green fluorescent protein 14; eerdere studies niet aan deze projectie te vinden met behulp van klassieke tracers zonder reporter genamplificatie 11,15. HelaasVeel tracing virale vectoren, zoals die gebruikt in de aangehaalde onderzoek niet synapsen kruisen, waardoor het gebruik ervan voor het opsporen multi-synaptische circuits beperken.
Terwijl de presentatie duidelijke voordelen voor het identificeren van het netwerk van cellen die deelnemen in een motorcircuit, de gedistribueerde aard van transsynaptische tracing met PRV-152 maakt het interpreteren van specifieke verbindingen binnen het circuit moeilijk. Daarom presenteren we een eenvoudige methode voor het valideren van specifieke verbindingen binnen circuits geïdentificeerd met PRV-152 door double-labeling gebruikt gebiotinyleerd dextran amines (BDA) en choleratoxine subunit B (CTB). Het gecombineerde gebruik van BDA en CTB is een gevestigde aanpak voor het opsporen van verbanden tussen specifieke sets van neuronen 6-8,11. Wanneer samen gebruikt worden, kunnen deze twee tracers worden gevisualiseerd in dezelfde sectie in twee kleuren DAB (3, 3'-diaminobenzidine) 16 procedure. Hoog molecuulgewicht BDA (BDA10kDa) werd gekozen voor dit protocol omdat yields gedetailleerde etikettering van neuronale processen 6,7,9. Bijkomende voordelen van BDA10kDa zijn de volgende: het is bij voorkeur in de richting anterograde 6-8 vervoerd; Het kan worden geleverd door iontoforetische of druk injectie 6-8; kan worden gevisualiseerd door een eenvoudige avidine-gebiotinyleerde HRP (ABC) procedure 17; en kan worden afgebeeld door licht- of elektronenmicroscopie 6,7,18. Immunochemische detectie van CTB met peroxidase en DAB werd gekozen retrograde labeling van motoneuronen omdat het effectief is bij het openbaren cellulaire processen, waaronder distale dendrieten 10,19. We hebben onlangs gebruikt deze benadering van de vocale motor route bij muizen te identificeren en een dunne aansluiting van de primaire motorische cortex aan de larynx motorische neuronen, die eerder werd aangenomen afwezig 20 te onthullen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn een aantal zaken die in overweging moeten worden genomen bij de planning van een experiment met PRV152 4,21. Belangrijker, pseudorabiësvirus is dodelijk. Zoals eerder vermeld, mensapen, waaronder mensen zijn niet gevoelig voor infectie, maar juiste zorg moet worden uitgeoefend om andere dieren te beschermen. Volwassen muizen overleven doorgaans 5-7 dagen na inoculatie met de verzwakte stam PRV152. Daarom PRV152 niet geschikt voor experimenten die overleving langer dan één week nodig. Bovendien besm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr. Toshio Terashima van Kobe University, Japan, voor het onderwijzen van de larynx operatietechniek, en Dr. Lynn Enquist van Princeton University voor het leveren van PRV-Bartha. Onderzoek werd gesteund door NIH pionier award DP1 OD000448 aan Erich D. Jarvis en een NSF Graduate Research Fellowship award naar Gustavo Arriaga. Uit cijfers van de juiste gecrediteerd eerdere werk worden gebruikt onder de PLoS ONE open toegang Creative Commons licentie (CC-BY) in overeenstemming met de redactionele beleid van het tijdschrift.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| NanoFil Microinjection System | World Precision Instruments | IO-Kit | 34 gauge option |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | Model 900 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| [header] | |||
| VetBond | 3M | 1469SB | |
| Isofluorane (Forane) | Baxter | 1001936060 | |
| Betadine Swab Stick | Cardinal Health | 2130-01 | 200 count |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Biotinylated dextran amines | Invitrogen | D-1956 | 10,000 MW |
| Pseudorabies virus | Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University) | PRV152 | Titer > 1 x 107 |
| Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat) | List Biological Laboratories | 703 | |
| Cholera Toxin B Subunit | List Biological Laboratories | 103B | |
| Anti-eGFP | Open Biosystems | ABS4528 | |
| 3, 3'-diaminobenzidine | Sigma-Aldrich | D5905 | 10 mg tablets |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H3410 | 30% |
| Ketamine HCl & Xylazine HCl | Sigma-Aldrich | K4138 | 80 mg/mL & 6 mg/mL |
| Nickel chloride | Sigma-Aldrich | 339350 | |
| Phosphate buffer | Sigma-Aldrich | P3619 | 1.0 M; pH 7.4 |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10X; pH 7.4 |
| Sodium Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | 50 mg/mL dose |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 534056 | Histological grade |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat) | |
| Optixcare opthalmic ointment | Vet Depot | 1017992 |
References
- Card, J. P., Enquist, L. W. . Transneuronal circuit analysis with pseudorabies viruses.Multiple values selected. Unit 1.5, 1.51-1.5.28 (2001).
- Smith, B. N., Banfield, B. W., et al. Pseudorabies virus expressing enhanced green fluorescent protein: a tool for in vitro electrophysiological analysis of transsynaptically labeled neurons in identified central nervous system circuits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (16), 9264-9269 (2000).
- Aston Jones, G., Card, J. P. Use of pseudorabies virus to delineate multisynaptic circuits in brain opportunities and limitations. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 51-61 (2000).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
- Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
- Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of neuroscience. 103, 23-37 (2000).
- Reiner, A., Honig, M. G. Neuroanatomical tract-tracing 3 (Chapter 10). Dextran Amines Versatile Tools for Anterograde and Retrograde Studies of Nervous System Connectivity. 10, 304-335 (2006).
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single and double labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
- Rajakumar, N., Elisevich, K., Flumerfelt, B. A. Biotinylated dextran a versatile anterograde and retrograde neuronal tracer. Brain Research. 607 (1-2), 47-53 (1993).
- Dederen, P. J. W. C., Gribnau, A. A. M., Curfs, M. H. J. M. Retrograde neuronal tracing with cholera toxin B subunit: comparison of three different visualization methods. Histochemical Journal. 26 (11), 856-862 (1994).
- Hattox, A. M., Priest, C. A., Keller, A. Functional circuitry involved in the regulation of whisker movements. The Journal of Comparative Neurology. 442 (3), 266-276 (2002).
- Bartha, A. Experimental reduction of virulence of Aujeszkys disease virus. Magy Allatorv Lapja. 16, 42-45 (1961).
- Kuypers, H., Ugolini, G. Viruses as transneuronal tracers. Trends in Neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).
- Grinevich, V., Brecht, M., Osten, P. Monosynaptic pathway from rat vibrissa motor cortex to facial motor neurons revealed by lentivirus-based axonal tracing. The Journal of Neuroscience. 25 (36), 8250-8258 (2005).
- Miyashita, E., Keller, A., Asanuma, H. Input output organization of the rat vibrissal motor cortex. Experimental Brain Research. 99 (2), 223-232 (1994).
- Hsu, S. M., Soban, E. Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).
- Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. Use of avidin biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).
- Wouterlood, F. G., Jorritsma Byham, B. The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine comparison with the tracer Phaseolus vulgaris leucoagglutinin in preparations for electron microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 48 (1-2), 75-87 (1993).
- Altschuler, S. M., Bao, X. M., Miselis, R. R. Dendritic architecture of nucleus ambiguus motoneurons projecting to the upper alimentary tract in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 309 (3), 402-414 (1991).
- Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. Of mice birds and men the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and songlearning birds. PLoS ONE. 7 (10), e46610 (2012).
- Card, J. P. Practical considerations for the use of pseudorabies virus in transneuronal studies of neural circuitry. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 22 (6), 685-694 (1998).
- Zuckerman, F. A., Zsak, L., Mettenleiter, T. C., Ben Porat, T. Pseudorabies virus glycoprotein gIII is a major target antigen for murine and swine virus-specific cytotoxic T lymphocytes. Journal of Virology. 64 (2), 802-812 (1990).
- Card, J. P., Enquist, L. W., Moore, R. Y. Neuroinvasiveness of pseudorabies virus injected intracerebrally is dependent on viral concentration and terminal field density. The Journal of Comparative Neurology. 407 (3), 438-452 (1999).
- Pickard, G. E., Smeraski, C. A., et al. Intravitreal injection of the attenuated pseudorabies virus PRV Bartha results in infection of the hamster suprachiasmatic nucleus only by retrograde transsynaptic transport via autonomic circuits. The Journal of Neuroscience. 22 (7), 2701-2710 (2002).
- Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Herpesviruses use bidirectional fast axonal transport to spread in sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466-3470 (2001).
