Transsynaptisk Tracing från perifera mål med pseudorabiesvirus Följt av koleratoxin och Biotinyliserad Dextran Amines dubbel märkning
Summary
Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.
Abstract
Transsynaptisk spårning har blivit ett kraftfullt verktyg som används för att analysera centrala efferents som reglerar perifera mål genom flera synaptiska kretsar. Detta tillvägagångssätt har mest använda i hjärnan genom att utnyttja svinpatogenen pseudorabiesvirus (PRV) 1. PRV smittar inte människoapor, inklusive människor, så det är vanligast i studier på små däggdjur, särskilt gnagare. Den pseudorabiesstam PRV152 uttrycker förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP) reportergen och endast korsar funktionella synapser retrograd genom den hierarkiska sekvensen av synapsförbindelser bort från infektionsstället 2,3. Andra PRV stammar har tydliga mikrobiologiska egenskaper och kan transporteras i båda riktningarna (PRV-Becker och PRV-Kaplan) 4,5. Detta protokoll kommer att enbart behandla PRV152. Genom att leverera viruset vid en perifer plats, såsom muskel, är det möjligt att begränsa inträde av viruset i Than hjärnan genom en specifik uppsättning nervceller. Det resulterande mönstret av EGFP-signalen i hela hjärnan löser därefter de neuroner som är anslutna till de initialt infekterade celler. Som den distribuerade karaktär transsynaptisk spårning med pseudorabiesvirus gör att tolka vissa anslutningar inom en identifierad nätverk svårt, presenterar vi en känslig och tillförlitlig metod som använder biotinylerade dextran aminer (BDA) och koleratoxin subenhet B (CTB) för att bekräfta sambandet mellan celler som identifieras med hjälp av PRV152. Immunokemisk detektion av BDA och CTB med peroxidas och DAB (3, 3'-diaminobensidin) valdes därför att de är effektiva på att avslöja cellulära processer inklusive distala dendriter 6-11.
Introduction
Transsynaptisk spårning har blivit ett kraftfullt verktyg som används för att analysera centrala efferents som reglerar perifera mål genom flera synaptiska kretsar. Detta tillvägagångssätt har mest flitigt i gnagare hjärnan genom att utnyttja svin patogen pseudorabiesvirus (PRV), särskilt den försvagade stammen PRV-Bartha först beskrevs 1961 12. Här presenterar vi ett protokoll för att identifiera motor kortikala representation av specifika muskler eller muskelgrupper med användning av en rekombinant pseudorabiesvirusstam (PRV152) som uttrycker förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP) reportergen 2. Den beskrivna metoden utnyttjar beteende neurotropa virus, som producerar infektiös avkomma som tvär synapser att infektera andra nervceller i en funktionell krets 3,4,13. PRV152, vilket är isogen med PRV-Bartha, korsar bara synapser retrograd genom den hierarkiska sekvens av synapsförbindelser bort från infektionsstället 3,5 </ sup>. Genom att exakt kontrollera den perifera infektionsstället är det möjligt att begränsa inträde av viruset in i hjärnan genom en särskild undergrupp av motomeuroner. Eftersom viruset sekventiellt infekterar kedjor av anslutna nervceller, kommer det resulterande mönstret av EGFP-signalen i hela hjärnan sedan lösa det nätverk av neuroner som är anslutna till de initialt infekterade celler.
En ytterligare fördel med att använda viruset för neural spårning är amplifieringen av reporterproteinet (EGFP i detta fall) i infekterade celler. Denna signal förstärkning ger en nivå av känslighet som tillåter detektion av även glesa utsprång. Till exempel var en gles utsprång från vibrissa motoriska cortex till ansikts motoriska nervceller som styr hårkristaller hittades på råttor med användning viralt uttryckt grönfluorescerande protein 14; tidigare studier misslyckats med att hitta denna projektion med hjälp av klassiska spårämnen utan reportergen förstärkning 11,15. Tyvärr, Många virala spårning vektorer, som den som används i den citerade studien, korsa inte synapser, vilket begränsar deras användning för att spåra fler synaptiska kretsar.
Medan presentera tydliga fördelar för att identifiera nätverket av celler som deltar i en motorkrets, distribuerade karaktär transsynaptisk spårning med PRV-152 gör att tolka vissa anslutningar inom kretsen svårt. Därför presenterar vi en enkel metod för att validera specifika anslutningar inom kretsar identifieras med hjälp av PRV-152 genom att dubbelmärkning med hjälp av biotinylerade dextran aminer (BDA) och koleratoxin subenhet B (CTB). Den kombinerade användningen av BDA och CTB är en väletablerad metod för att spåra kopplingar mellan specifika typer av nervceller 6-8,11. När de används tillsammans, kan dessa två spår visualiseras i samma avsnitt med hjälp av en tvåfärgad DAB (3, 3 'diaminobensidin) förfarandet 16. Högmolekylärt BDA (BDA10kDa) valdes för detta protokoll eftersom det yields detaljerad märkning av neuronala processer 6,7,9. Ytterligare fördelar med BDA10kDa innefattar följande: det är företrädesvis transporteras i antero riktningen 6-8; det kan levereras av jontoforetiskt eller tryck injektion 6-8; det kan visualiseras genom en enkel avidin-biotinylerat HRP (ABC) förfarande 17; och den kan förses med bild genom ljus- eller elektronmikroskopi 6,7,18. Immunokemisk detektion av CTB med peroxidas och DAB valdes för retrograd märkning av motoneuroner eftersom det är effektivt vid avslöjande cellulära processer inklusive distala dendriter 10,19. Vi använde nyligen denna metod för att identifiera röstmotorvägen hos möss och att avslöja en gles anslutning från primära motoriska cortex till laryngeala motoriska nervceller, som tidigare antogs vara frånvarande 20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns ett antal frågor som måste beaktas när man planerar ett experiment med PRV152 4,21. Viktigast är pseudorabiesvirus dödlig. Som tidigare nämnts, stora apor, inklusive människor är inte mottagliga för smitta, men lämplig vård måste iakttas för att skydda andra djur. Vuxna möss överlever vanligtvis fem till sju dagar efter ympning med den försvagade PRV152 stammen. Därför är PRV152 inte lämpligt för experiment som kräver överlevnadstider längre än en vecka. Dessutom infekterade…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr Toshio Terashima i Kobe University, Japan, för att lära av laryngeal kirurgi teknik, och Dr. Lynn Enquist av Princeton University för att leverera PRV-Bartha. Forskningen stöddes av NIH pionjär utmärkelse DP1 OD000448 till Erich D. Jarvis och en NSF Graduate Research Fellowship utmärkelse till Gustavo Arriaga. Siffror från lämpligt kredit tidigare arbete används under PLoS ONE open access Creative Commons-licens (CC-BY) i enlighet med tidskriftens redaktionella politik.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| NanoFil Microinjection System | World Precision Instruments | IO-Kit | 34 gauge option |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | Model 900 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| [header] | |||
| VetBond | 3M | 1469SB | |
| Isofluorane (Forane) | Baxter | 1001936060 | |
| Betadine Swab Stick | Cardinal Health | 2130-01 | 200 count |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Biotinylated dextran amines | Invitrogen | D-1956 | 10,000 MW |
| Pseudorabies virus | Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University) | PRV152 | Titer > 1 x 107 |
| Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat) | List Biological Laboratories | 703 | |
| Cholera Toxin B Subunit | List Biological Laboratories | 103B | |
| Anti-eGFP | Open Biosystems | ABS4528 | |
| 3, 3'-diaminobenzidine | Sigma-Aldrich | D5905 | 10 mg tablets |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H3410 | 30% |
| Ketamine HCl & Xylazine HCl | Sigma-Aldrich | K4138 | 80 mg/mL & 6 mg/mL |
| Nickel chloride | Sigma-Aldrich | 339350 | |
| Phosphate buffer | Sigma-Aldrich | P3619 | 1.0 M; pH 7.4 |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10X; pH 7.4 |
| Sodium Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | 50 mg/mL dose |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 534056 | Histological grade |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat) | |
| Optixcare opthalmic ointment | Vet Depot | 1017992 |
References
- Card, J. P., Enquist, L. W. . Transneuronal circuit analysis with pseudorabies viruses.Multiple values selected. Unit 1.5, 1.51-1.5.28 (2001).
- Smith, B. N., Banfield, B. W., et al. Pseudorabies virus expressing enhanced green fluorescent protein: a tool for in vitro electrophysiological analysis of transsynaptically labeled neurons in identified central nervous system circuits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (16), 9264-9269 (2000).
- Aston Jones, G., Card, J. P. Use of pseudorabies virus to delineate multisynaptic circuits in brain opportunities and limitations. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 51-61 (2000).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
- Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
- Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of neuroscience. 103, 23-37 (2000).
- Reiner, A., Honig, M. G. Neuroanatomical tract-tracing 3 (Chapter 10). Dextran Amines Versatile Tools for Anterograde and Retrograde Studies of Nervous System Connectivity. 10, 304-335 (2006).
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single and double labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
- Rajakumar, N., Elisevich, K., Flumerfelt, B. A. Biotinylated dextran a versatile anterograde and retrograde neuronal tracer. Brain Research. 607 (1-2), 47-53 (1993).
- Dederen, P. J. W. C., Gribnau, A. A. M., Curfs, M. H. J. M. Retrograde neuronal tracing with cholera toxin B subunit: comparison of three different visualization methods. Histochemical Journal. 26 (11), 856-862 (1994).
- Hattox, A. M., Priest, C. A., Keller, A. Functional circuitry involved in the regulation of whisker movements. The Journal of Comparative Neurology. 442 (3), 266-276 (2002).
- Bartha, A. Experimental reduction of virulence of Aujeszkys disease virus. Magy Allatorv Lapja. 16, 42-45 (1961).
- Kuypers, H., Ugolini, G. Viruses as transneuronal tracers. Trends in Neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).
- Grinevich, V., Brecht, M., Osten, P. Monosynaptic pathway from rat vibrissa motor cortex to facial motor neurons revealed by lentivirus-based axonal tracing. The Journal of Neuroscience. 25 (36), 8250-8258 (2005).
- Miyashita, E., Keller, A., Asanuma, H. Input output organization of the rat vibrissal motor cortex. Experimental Brain Research. 99 (2), 223-232 (1994).
- Hsu, S. M., Soban, E. Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).
- Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. Use of avidin biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).
- Wouterlood, F. G., Jorritsma Byham, B. The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine comparison with the tracer Phaseolus vulgaris leucoagglutinin in preparations for electron microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 48 (1-2), 75-87 (1993).
- Altschuler, S. M., Bao, X. M., Miselis, R. R. Dendritic architecture of nucleus ambiguus motoneurons projecting to the upper alimentary tract in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 309 (3), 402-414 (1991).
- Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. Of mice birds and men the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and songlearning birds. PLoS ONE. 7 (10), e46610 (2012).
- Card, J. P. Practical considerations for the use of pseudorabies virus in transneuronal studies of neural circuitry. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 22 (6), 685-694 (1998).
- Zuckerman, F. A., Zsak, L., Mettenleiter, T. C., Ben Porat, T. Pseudorabies virus glycoprotein gIII is a major target antigen for murine and swine virus-specific cytotoxic T lymphocytes. Journal of Virology. 64 (2), 802-812 (1990).
- Card, J. P., Enquist, L. W., Moore, R. Y. Neuroinvasiveness of pseudorabies virus injected intracerebrally is dependent on viral concentration and terminal field density. The Journal of Comparative Neurology. 407 (3), 438-452 (1999).
- Pickard, G. E., Smeraski, C. A., et al. Intravitreal injection of the attenuated pseudorabies virus PRV Bartha results in infection of the hamster suprachiasmatic nucleus only by retrograde transsynaptic transport via autonomic circuits. The Journal of Neuroscience. 22 (7), 2701-2710 (2002).
- Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Herpesviruses use bidirectional fast axonal transport to spread in sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466-3470 (2001).
