Individuare, visualizzare e quantificare la generazione di specie reattive dell'ossigeno in un modello di sistema di Amoeba
Summary
Abbiamo adattato una serie di protocolli per la misurazione delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) che possono essere applicate in vari modelli cellulari amebe e di mammifero per studi qualitativi e quantitativi.
Abstract
Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) comprendono una gamma di molecole contenenti ossigeno reattive e di breve durata, che sono interconvertiti o eliminati sia catalitica o spontaneamente in modo dinamico. A causa delle brevi durate di più ROS e la diversità delle loro fonti e localizzazioni subcellulari, un quadro completo può essere ottenuto solo da misure accurate utilizzando una combinazione di protocolli. Qui, vi presentiamo una serie di tre protocolli diversi con OxyBurst Green (OBG) rivestite perline, o dihydroethidium (DHE) e Amplex Ultrared (AUR), di monitorare qualitativamente e quantitativamente diversi ROS in fagociti professionali come Dictyostelium. Abbiamo ottimizzato le perline procedure di rivestimento e perle di OBG rivestite occasione e la microscopia diretta di visualizzare dinamicamente intraphagosomal generazione di ROS a livello di singola cellula. Abbiamo identificato lipopolisaccaride (LPS) da E. coli come stimolatore potente per la generazione di ROS in Dictyostelium. Inoltre, Dtempo reale eveloped, saggi medio-throughput utilizzando DHE e AUR per misurare quantitativamente superossido intracellulare ed extracellulare H 2 O 2 produzione, rispettivamente.
Introduction
Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono coinvolti in una vasta gamma di processi biologici quali la difesa ospite, la segnalazione, lo sviluppo del tessuto e la risposta al danno, così come l'ipertensione e il cancro. Il macchinario ossidasi phagosomal NADPH ben studiato è dedicato alla generazione di ROS rapido, conosciuto come il burst ossidativo, per uccidere i batteri ingeriti in phagosomes neutrofili '1. Inoltre, la perdita di elettroni come sottoprodotto della catena respiratoria mitocondriale è stato precedentemente ritenuto responsabile solo per una fonte regolamentata di ROS. Ma di recente, è stato identificato come un importante meccanismo per contribuire all'uccisione intraphagosomal dei batteri nei macrofagi del mouse 2. Negli ultimi anni, l'ameba sociale, Dictyostelium, è diventata un modello potente e popolare per studiare i meccanismi cellulari intrinseche della risposta immunitaria innata. Infatti, Dictyostelium e fagociti umani condividono un sorprendentemente elevato livello di conservazione in moleculamacchinari r responsabili per i batteri rilevamento, fagocitazione e uccidendo 3,4. Gli omologhi di proteine ed enzimi legati alla produzione di ROS o di detossificazione, come ossidasi NADPH, catalasi, superossido dismutasi, possono essere trovati in umano e Dictyostelium. Come l'ameba più studiato, Dictyostelium presenta diversi vantaggi unici rispetto sistema modello mammiferi. Crescono a temperatura ambiente senza la necessità di CO 2, con un tempo di raddoppio di 8-10 ore. Possono essere facilmente mantenute come colture aderenti o sospensione. Inoltre, grazie alla loro genoma aploide completamente sequenziato e annotato, e alla manipolazione genetica facile, Dictyostelium è diventata una molto attraente sperimentale organismo modello.
In studi precedenti, vari derivati clorurati e fluorurati di fluoresceina (collettivamente noti come OxyBurst verde, OBG) che emettono fluorescenza dopo ossidazione da ROS, sono stati utilizzati come reporter ROS. Cell-permeante estDerivati erified vengono utilizzati per misurare citoplasmatica ROS, che destrano-o derivati cellule impermeant accoppiati a proteine sono utilizzati per misurare extracellulare ROS. In particolare, perline OBG BSA-rivestite sono già stati utilizzati per rilevare phagosomal produzione di ROS in cellule di mammifero 5. Tuttavia, l'approccio lettore-su micropiastra può solo dare una curva di generazione di ROS mediata da una popolazione di cellule. Con la presente protocollo base Dictyostelium, un fagocita professionale, e le condizioni sperimentali ottimizzate, otteniamo fagocitosi stabile ed efficiente senza coniugando qualsiasi opsonina sulle perline. DHE è stato utilizzato in vari sistemi modello, come neutrofili e macrofagi mammiferi, per rilevare la produzione di ROS 6-9. Nel frattempo, vi sono alcune controversie sulla specificità e sensibilità del metodo 8,10. Come una versione migliorata del Amplex Red, l'intensità di fluorescenza di RUA è meno sensibile al pH, che lo rende più adatto da misurareROS in ambienti nonneutral o debolmente acide. AUR è stato recentemente applicato in diversi sistemi di mammifero 11,12, ma il suo uso in modelli non mammiferi, che spesso richiedono mezzi di crescita debolmente acido, non è stato ancora riportato. Inoltre, non esiste un protocollo pubblicato per quantitativamente e dinamicamente misurare la produzione di ROS e la localizzazione nel ameba sociale Dictyostelium.
L'obiettivo del set di protocolli presentato è quello di fornire una soluzione semplice e versatile per il controllo di diversi ROS e la loro localizzazione, e in seguito invia intuizioni meccanismi cellulari ROS-correlati. Per il saggio OBG, abbiamo usato la microscopia diretta a monitorare l'intero processo di generazione phagosomal ROS, dopo l'assorbimento di perline OBG rivestite da cellule di Dictyostelium, e fornito un nuovo approccio per studiare il meccanismo di uccisione intraphagosomal dei batteri. Abbiamo ottimizzato medio-throughput DHE e AUR saggi in Dictyostelium, per misurare superox intracellulareide extracellulare e H 2 O 2 produzione, rispettivamente, utilizzando LPS come un potente stimolatore ROS. Si noti che LPS è stato recentemente mostrato di aumentare l'attività battericida del Dictyostelium verso batteri fagocitati 13. Inoltre, il trattamento con DEDTC e catalasi esplicitamente confermato che questi due metodi specificamente misurano diversi tipi e localizzazioni subcellulari di ROS in Dictyostelium. Infine, il saggio OBG può essere adattato a qualsiasi cellula fagocitica aderente per ulteriori opsonizzare le perline con ligandi per recettori di fagocitosi di cellule animali. In linea di principio, i saggi DHE e AUR può anche essere ottimizzati per misure in qualsiasi cella aderenti o non aderenti sotto appropriate condizioni sperimentali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rispetto ai metodi precedentemente descritti, il saggio OBG visualizza dinamicamente il processo di phagosomal generazione di ROS a livello di singola cellula, invece di misurare un segnale medio ROS da una popolazione di cellule. Tali metodi popolazione calcolo della media tendono a oscurare le informazioni critiche causate dalla fagocitosi nonsynchronous. Abbiamo adattato con successo DHE e AUR saggi di Dictyostelium e ottimizzato i protocolli. Soprattutto, abbiamo specificato i tipi e localizzazioni subcellu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati al Dott. Karl-Heinz Krause e Vincent Jaquet per aiuto e consiglio per impostare questi protocolli, e ringraziamo anche Christoph Bauer e Jérôme Bosset dalla piattaforma Bioimmagini del PRN e il Dr. Navin Gopaldass per il loro supporto tecnico. La ricerca è supportata da una sovvenzione ProDoc della National Science Foundation svizzero.
Materials
| REAGENTS | |||
| OxyBURST Green H2HFF BSA | Invitrogen | O-13291 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-20004 | |
| Carboxylated silica beads | Kisker Biotech | PSi-3.0COOH | |
| HL5C medium | ForMedium | HLC0102 | |
| LoFlo medium | ForMedium | LF1001 | |
| Bacto agar | BD | 204010 | |
| Dihydroethidium | Sigma | 37291-25MG | |
| Amplex UltraRed | Invitrogen | A36006 | |
| Horseradish peroxidase | Roche | 10108090001 | |
| Diethyldithiocarbamate (DEDTC) | Sigma | D3506-100G | |
| Catalase | Sigma | C9322-1G | |
| Cyanamide | Sigma | 187364-25G | |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L2630-25G | |
| EQUIPMENT | |||
| ibidi μ-Dish 35 mm, high | ibidi | 81156 | Bottom made of optically clear plastic |
| MatTek dish 35 mm | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C | Bottom made of a glass coverslip |
| Scepter Cell Counter | Merck Millipore | PHCC00000 | |
| White 96 well plate | Nunc | 236108 | |
| Centrifuge | SORVALL | Legend RT | |
| Microplate reader | BioTek | Synergy Mx |
References
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