、検出し可視化し、アメーバモデル系で活性酸素種の生成を定量
Summary
我々は、定性的および定量的研究のための様々なアメーバおよび哺乳動物細胞モデルに適用することができる反応性酸素種（ROS）の測定のためのプロトコルのセットを適合。
Abstract
活性酸素種（ROS）のいずれかを動的に触媒的または自然に相互変換又は排除される反応性短命の、酸素含有分子の範囲を含む。最もによるROS及びそれらのソースおよび細胞内局在の多様性の短い寿命のために、全体像は、プロトコルの組み合わせを用いて注意深く測定することによって得ることができる。ここでは、OxyBurstグリーン（OBG）を使用して、三つの異なるプロトコルのセットをコーティングしたビーズ、またはジヒドロエチ（DHE）を提示し、アンプレックスUltraRed（AUR）は、定性的および定量的な細胞性粘菌などの専門食細胞内の様々な活性酸素を監視すること。我々は手順をコーティングビーズを最適化し、動的単一細胞レベルでintraphagosomal ROS生成を可視化するOBGコートビーズとライブ顕微鏡を使用していました。我々は、 大腸菌からリポ多糖（LPS）を同定細胞性粘菌におけるROS生成のための強力な刺激として大腸菌 。また、我々は、dはリアルタイム定量的にそれぞれ、細胞内および細胞外スーパーオキシドH 2 O 2産生を測定するためDHEとAURを用いて媒体スループットアッセイをeveloped。
Introduction
活性酸素種（ROS）は、宿主防御、シグナル伝達、組織の発達および損傷に対する反応、ならびに高血圧症および癌などの生物学的プロセスの様々に関与している。よく研究ファゴソームNADPHオキシダーゼの機械は、好中球'ファゴソーム1で摂取細菌を殺すために、酸化的バーストとして知られている急速なROS発生、に捧げられています。また、ミトコンドリア呼吸鎖の副産物としての電子の漏れが以前はROSの規制されていない元の原因であると考えられていた。しかし、最近では、マウスマクロファージ2中の細菌の死滅intraphagosomalに貢献する重要な機構として同定された。近年では、社会的なアメーバ、 細胞性粘菌は 、自然免疫応答の細胞本来のメカニズムを研究するための強力かつ人気の高いモデルとなっています。実際、 細胞性粘菌と人間の食細胞はmoleculaにおける保全の驚くほど高いレベルを共有細菌は、飲み込みを感知して、3,4を殺すための責任のR機械。このような、NADPHオキシダーゼ、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、などのROS産生や解毒に関わるタンパク質や酵素のホモログは、人間と細胞性粘菌の両方に記載されています。最もよく研究され、アメーバのように、 細胞性粘菌は、哺乳類のモデル系に比べていくつかのユニークな利点を提供します。それらは、8〜10時間の倍加時間で、CO 2を必要とせずに室温で成長する。それらは容易に付着または懸濁培養物として維持することができる。また、彼らの完全に配列決定し、注釈付きの半数体ゲノムに、かつ容易に遺伝子操作のおかげで、 細胞性粘菌は非常に魅力的な実験モデル生物となっています。
これまでの研究では、活性酸素による酸化後に蛍光を発する（総称OxyBurstグリーン、OBGとして知られている）フルオレセインの様々な塩素化およびフッ素化誘導体は、活性酸素のレポーターとして使用されてきた。細胞透過性EST細胞非透過性デキストラン又はタンパク質結合誘導体は、細胞外ROSを測定するために使用される一方erified誘導体は、細胞質のROSを測定するために使用される。特に、OBG BSA-コーティングされたビーズは、既に哺乳類細胞5ファゴソーム内ROS産生を検出するために使用されてきた。しかし、マイクロプレートリーダーベースのアプローチは、細胞の集団からの平均ROSの生成カーブを与えることができる。現在のプロトコルでは、 細胞性粘菌 、専門の食細胞、および最適化された実験条件を使用することにより、我々は、ビーズ上に任意のオプソニンを結合させることなく、安定的かつ効率的な食作用を得る。 DHEは、ROS産生6-9を検出するために、そのような哺乳動物好中球およびマクロファージなどの種々のモデル系において使用されている。一方、メソッド8,10の特異性と感度をある程度の論争があります。アンプレックスレッドの改良版として、AURの蛍光強度を測定することがより適してpHに対する感度が低い非中性または弱酸性的環境におけるROS。 AURは最近、いくつかの哺乳類系11,12が、非常に多くの場合、弱酸性増殖培地を必要とする非哺乳類モデルにおけるその使用に適用されている、まだ報告されていない。また、定量的かつ動的な社会アメーバ細胞性粘菌におけるROS産生および局在を測定するための公表プロトコルがありません。
プロトコルの提示組の目標は、様々なROS及びそれらの局在をモニタリングすることが容易で汎用性の高いソリューションを提供し、さらにROS関連の細胞機構への洞察を与えることである。 OBGアッセイのために、我々は、 細胞性粘菌細胞によるOBG被覆ビーズの取り込み後のファゴソームROS生成のプロセス全体を監視するために、ライブ顕微鏡を用いて、細菌のintraphagosomal死滅の機序を研究するための新しいアプローチを提供した。我々は、細胞内superoxを測定するために、 細胞性粘菌媒体スループットDHEとAURアッセイを最適化した強力なROS刺激剤としてLPSを使用して、それぞれIDEおよび細胞外のH 2 O 2の生産、、。 LPSが最近貪食細菌13に向けて細胞性粘菌の殺菌活性を増加させることが示されたことに注意してください。また、DEDTCおよびカタラーゼを用いた治療は、明示的にこれらの2つの方法を具体的に、異なる種類や細胞性粘菌におけるROSの細胞内局在を測定することを確認した。最後に、OBGアッセイは、さらに、動物細胞の食作用性受容体のリガンドでビーズをオプソニン化することにより、任意の接着性食細胞に適合させることができる。原則として、DHEおよびAURアッセイはまた、適切な実験条件下で任意の接着性または非接着性の細胞で測定用に微調整することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
前述の方法に比べて、OBGアッセイは、動的に代えて、細胞の集団からの平均ROSシグナルを測定する、単一細胞レベルでファゴソームROS生成の過程を視覚化する。このような人口の平均化の方法は非同期食作用によって引き起こされる重要な情報を不明瞭にする傾向があります。我々が正常に細胞性粘菌にDHEとAURアッセイを適応とプロトコルを最適化した。最も重要なことは、我々はこ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、ヘルプと、これらのプロトコルを設定するために助言を博士カール·ハインツ·クラウスとヴィンセントジャケに感謝していて、また、それらの技術的なサポートのためにNCCR博士ナビンGopaldassのバイオイメージングプラットフォームからクリストフ·バウアーとジェローム若いアカシカの未発達の枝角に感謝します。研究は、スイス国立科学財団のProDoc助成金によってサポートされています。
Materials
| REAGENTS | |||
| OxyBURST Green H2HFF BSA | Invitrogen | O-13291 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-20004 | |
| Carboxylated silica beads | Kisker Biotech | PSi-3.0COOH | |
| HL5C medium | ForMedium | HLC0102 | |
| LoFlo medium | ForMedium | LF1001 | |
| Bacto agar | BD | 204010 | |
| Dihydroethidium | Sigma | 37291-25MG | |
| Amplex UltraRed | Invitrogen | A36006 | |
| Horseradish peroxidase | Roche | 10108090001 | |
| Diethyldithiocarbamate (DEDTC) | Sigma | D3506-100G | |
| Catalase | Sigma | C9322-1G | |
| Cyanamide | Sigma | 187364-25G | |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L2630-25G | |
| EQUIPMENT | |||
| ibidi μ-Dish 35 mm, high | ibidi | 81156 | Bottom made of optically clear plastic |
| MatTek dish 35 mm | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C | Bottom made of a glass coverslip |
| Scepter Cell Counter | Merck Millipore | PHCC00000 | |
| White 96 well plate | Nunc | 236108 | |
| Centrifuge | SORVALL | Legend RT | |
| Microplate reader | BioTek | Synergy Mx |
References
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