Обнаружение, Визуализация и количественного генерации активных форм кислорода в модельной системе Amoeba
Summary
Мы адаптировали набор протоколов для измерения активных форм кислорода (АФК), которые могут применяться в различных амебы и млекопитающих клеточных моделях для качественных и количественных исследований.
Abstract
Активные формы кислорода (ROS), включают различные реактивных и короткоживущих, кислородсодержащих молекул, которые динамически друг в друга или устранены либо каталитически или спонтанно. Из-за коротких из продолжительности жизни большей АФК и разнообразие их источников и субклеточных локализаций, полная картина может быть получена только путем тщательных измерений, используя комбинацию протоколов. Здесь мы представляем набор из трех различных протоколов, используя OxyBurst зеленый (OBG) покрытием бисер, или dihydroethidium (DHE) и Amplex Ultrared (AUR), чтобы контролировать качественно и количественно различные ROS в профессиональных фагоцитов, таких как Dictyostelium. Мы оптимизировали процедуры покрытия бисер и использовали бисер OBG-покрытием и живой микроскопии динамически визуализировать intraphagosomal ROS поколения на уровне одной клетки. Мы определили липополисахарида (ЛПС) из Е. палочка как мощный стимулятор для генерации АФК в Dictyostelium. Кроме того, мы гeveloped реального времени, средне-пропускной анализ с использованием DHE и ОЗМ количественно измерить внутриклеточный супероксид и внеклеточный H 2 O 2 производства, соответственно.
Introduction
Активные формы кислорода (ROS) участвуют в самых разнообразных биологических процессов, таких как иммунной защиты, сигнализации, развитие тканей и ответ на повреждение, а также гипертензии и рака. Хорошо изучены phagosomal НАДФН оксидазы техника посвящена быстрой генерации АФК, известный как окислительный взрыв, чтобы убить бактерии поступать в организм в нейтрофилов фагосом 1. Кроме того, утечка электронов как побочный продукт дыхательной цепи митохондрий Ранее считалось, что отвечает только за нерегулируемой источника АФК. Но в последнее время, он был идентифицирован как важного механизма содействия intraphagosomal убийства бактерий в макрофагах мыши 2. В последние годы социальная амеба, Dictyostelium, стала мощным и популярная модель для изучения клеток внутренние механизмы врожденного иммунного ответа. Действительно, Dictyostelium и человека фагоциты поделиться удивительно высокий уровень сохранения в молекулег механизмы, ответственные за бактерии чувствуя, поглощения и уничтожения 3,4. В гомологи белков и ферментов, связанных с производством или ROS детоксикации, такие как NADPH оксидазы, каталазы, супероксиддисмутаза, можно найти в обоих человеческих и Dictyostelium. Как наиболее изученного амебы, Dictyostelium представлены несколько уникальных преимуществ по сравнению млекопитающих модельной системы. Они растут при комнатной температуре без необходимости CO 2, с временем удвоения 8-10 часов. Они могут быть легко сохранены как прилипшие или суспензионных культур. Кроме того, благодаря своей полностью секвенировали и аннотированный гаплоидный геном, и в легкой генетических манипуляций, Dictyostelium стал очень привлекательным экспериментальная модель организм.
В предыдущих исследованиях, различные хлорированные и фторированные производные флуоресцеина (известных под общим названием OxyBurst Грин, OBG), которые излучают флуоресценции после окисления АФК, были использованы в качестве репортера АФК. Сотовый проникающий Предполагаемоеerified производные используются для измерения цитоплазматический ROS, в то время как декстран-или-белком производные клеток-impermeant используются для измерения внеклеточной ROS. В частности, бусы OBG BSA покрытием уже используется для обнаружения phagosomal производство АФК в клетках млекопитающих 5. Однако читатель подход микропланшет может дать только усредненную поколения РОС кривой от популяции клеток. С помощью настоящего протокола, с помощью Dictyostelium, профессиональный фагоцитов и оптимизированные условия эксперимента, получаем стабильную и эффективную фагоцитоз без сопряжения любой опсонин на шарики. ДНЕ был использован в различных модельных системах, таких как нейтрофилы и макрофаги млекопитающих, для обнаружения АФК 6-9. Между тем, есть некоторые разногласия по поводу специфичности и чувствительности метода 8,10. В качестве улучшенной версии Amplex красный, интенсивности флуоресценции AUR меньше чувствительны к рН, что делает его более подходящим для измеренияРОС в nonneutral или слабокислотных кругах. AUR был недавно применен в нескольких млекопитающих систем 11,12, но его использование в nonmammalian моделей, которые довольно часто требуют слабо кислой среде роста, не сообщалось еще. Кроме того, нет опубликован протокол количественно и динамично измерить АФК и локализацию в социальной амебы Dictyostelium.
Целью представленной набором протоколов, чтобы обеспечить легкий и универсальное решение для мониторинга различных АФК и их локализацию, а в дальнейшем дать понимание РОС-связанных клеточных механизмов. Для анализа OBG, мы использовали живую микроскопии для наблюдения за всем процессом производства phagosomal ROS После поглощения OBG покрытием бисера Dictyostelium клеток, и при условии, новый подход к изучению механизма intraphagosomal убийства бактерий. Мы оптимизировали среднего пропускной DHE и AUR анализы в Dictyostelium, для измерения внутриклеточного СуперОксIDE и внеклеточный H 2 O 2 производство, соответственно, с помощью LPS в качестве мощного стимулятора ROS. Обратите внимание, что ЛПС Недавно было показано, увеличить бактерицидную активность Dictyostelium к фагоцитированы бактерий 13. Кроме того, лечение с DEDTC и каталазы явно подтвердили, что эти два метода специально измерять различные типы и субклеточных локализаций АФК в Dictyostelium. Наконец, анализ OBG могут быть адаптированы к любой клейкого фагоцитарной клетки, путем дальнейшего opsonizing шарики с лигандов рецепторов фагоцитирующих клеток животных. В принципе, DHE и AUR анализы также могут быть доработаны для измерений в любой приверженец или неадгезивных клетки при соответствующих условиях эксперимента.
Protocol
Representative Results
Discussion
По сравнению с ранее описанными методами, анализ OBG динамически визуализирует процесс phagosomal ROS поколения на уровне одной клетки, вместо измерения среднего сигнала ROS из популяции клеток. Такие методы населения-усреднения, как правило, чтобы скрыть важную информацию, вызванного несинхр?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны докторами Карл-Хайнц Краузе и Винсент Jaquet за помощью и советом, чтобы настроить эти протоколы, а также поблагодарить Кристоф Бауэр и Джером Bosset от Bioimaging платформы НКРС и д-р Навин Gopaldass за техническую поддержку. Исследование опирается на ProDoc гранта Швейцарского национального научного фонда.
Materials
| REAGENTS | |||
| OxyBURST Green H2HFF BSA | Invitrogen | O-13291 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-20004 | |
| Carboxylated silica beads | Kisker Biotech | PSi-3.0COOH | |
| HL5C medium | ForMedium | HLC0102 | |
| LoFlo medium | ForMedium | LF1001 | |
| Bacto agar | BD | 204010 | |
| Dihydroethidium | Sigma | 37291-25MG | |
| Amplex UltraRed | Invitrogen | A36006 | |
| Horseradish peroxidase | Roche | 10108090001 | |
| Diethyldithiocarbamate (DEDTC) | Sigma | D3506-100G | |
| Catalase | Sigma | C9322-1G | |
| Cyanamide | Sigma | 187364-25G | |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L2630-25G | |
| EQUIPMENT | |||
| ibidi μ-Dish 35 mm, high | ibidi | 81156 | Bottom made of optically clear plastic |
| MatTek dish 35 mm | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C | Bottom made of a glass coverslip |
| Scepter Cell Counter | Merck Millipore | PHCC00000 | |
| White 96 well plate | Nunc | 236108 | |
| Centrifuge | SORVALL | Legend RT | |
| Microplate reader | BioTek | Synergy Mx |
References
- Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology. Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).
- West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472, 476-480 (2011).
- Fey, P., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Franke, J., Chisholm, R. L. dictyBase and the Dicty Stock Center. Methods Mol. Biol. 346, 51-74 (2006).
- Basu, S., et al. dictyBase 2013: integrating multiple Dictyostelid species. Nucleic Acids Res. 41, 676-683 (2013).
- VanderVen, B. C., Yates, R. M., Russell, D. G. Intraphagosomal measurement of the magnitude and duration of the oxidative burst. Traffic. 10, 372-378 (2009).
- Cohn, C. A., Simon, S. R., Schoonen, M. A. Comparison of fluorescence-based techniques for the quantification of particle-induced hydroxyl radicals. Part. Fibre Toxicol. 5, 2 (2008).
- Snyrychova, I., Ayaydin, F., Hideg, E. Detecting hydrogen peroxide in leaves in vivo – a comparison of methods. Physiol. Plant. 135, 1-18 (2009).
- Rodrigues, J. V., Gomes, C. M. Enhanced superoxide and hydrogen peroxide detection in biological assays. Free Radic. Biol. Med. 49, 61-66 (2010).
- Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. Analysis of Kinetics of Dihydroethidium Fluorescence with Superoxide Using Xanthine Oxidase and Hypoxanthine Assay. Ann. Biomed. Eng. , (2012).
- Lee, C. W., Chen, Y. C., Ostafin, A. The accuracy of Amplex Red assay for hydrogen peroxide in the presence of nanoparticles. J. Biomed. Nanotechnol. 5, 477-485 (2009).
- Guimaraes-Ferreira, L., et al. Short-term creatine supplementation decreases reactive oxygen species content with no changes in expression and activity of antioxidant enzymes in skeletal muscle. Eur. J. Appl. Physiol. 112, 3905-3911 (2012).
- Peng, D., et al. Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells. Gut. 61, 1250-1260 (2012).
- Walk, A., et al. Lipopolysaccharide enhances bactericidal activity in Dictyostelium discoideum cells. Dev. Comp. Immunol. 35, 850-856 (2011).
- Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis. Methods Cell Biol. 28, 347-356 (1987).
- Fey, P., Kowal, A. S., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Chisholm, R. L. Protocols for growth and development of Dictyostelium discoideum. Nat. Protoc. 2, 1307-1316 (2007).
- Bloomfield, G., Pears, C. Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium. J. Cell. Sci. 116, 3387-3397 (2003).
- Dieckmann, R., Gopaldass, N., Escalera, C., Soldati, T., Deretic, V. Autophagosomes and Phagosomes. Methods in Molecular Biology. 445, 317-328 (2008).
- Amir, Y., Edward, O. -. A., Utpal, B. A protocol for in vivo detection of reactive oxygen species. Proto. Exch. , (2008).
- Neuhaus, E. M., Soldati, T. A myosin I is involved in membrane recycling from early endosomes. J. Cell Biol. 150, 1013-1026 (2000).
