Kalciumfosfattransfektion av primär hippocampus nervceller
Summary
Kalciumfosfatutfällning är en praktisk och ekonomisk metod för transfektion av odlade celler. Med optimering, är det möjligt att använda denna metod på svår transfektera celler som primära neuroner. Här beskriver vi vår detaljerade protokoll för kalciumfosfattransfektion av hippocampus nervceller samodlades med astrogliaceller.
Abstract
Kalciumfosfatutfällning är en praktisk och ekonomisk metod för transfektion av odlade celler. Med optimering, är det möjligt att använda denna metod på svår transfektera celler som primära neuroner. Här beskriver vi vår detaljerade protokoll för kalciumfosfattransfektion av hippocampus nervceller samodlades med astrogliaceller.
Introduction
Primära nervceller är en av de svåraste celltyper för transfektion eftersom de är postmitotisk och är mycket känsliga för mikromiljöförändringar. Det finns fyra allmänt använda typer av metoder för expression av exogena gener och de korta hårnåls RNAs (shRNAs) i dessa celler 1. Var och en har sina egna fördelar och nackdelar. Till exempel är elektroporation vanligen utförs på nyisolerade neuroner 2, som celler måste överföras till kyvetter för transfektion. Virusinfektion kan oftast uppnå mycket hög verkningsgrad 3, men är mer arbetskrävande och riskabelt för operatörerna. Många lipid-medierad transfektion reagens är kommersiellt tillgängliga, med varierande grader av framgång i neuroner och olika nivåer av cytotoxicitet.
Kalciumfosfat transfektion representerar ett bekvämt och ekonomiskt sätt för att införa främmande gener i neuroner. Metoden användes först för att introducera adenovirus DNA i däggdjurs cells av Graham och van der Eb (1973) 4. Transfektion utfördes genom blandning av kalciumklorid med rekombinant-DNA i en fosfatbuffert. Detta möjliggör bildandet av DNA / kalciumfosfat utfällningar som när så småningom släpps på ett monolager av celler, hålla sig till cellytan, tas upp genom endocytos och slutligen in i kärnan 5. Denna process kommer att leda till expression av införda främmande gener i målcellen. Typiska effektivitetsvinsterna av kalciumfosfattransfektion intervall mellan 0,5-5% 6-8. Men med noggrann optimering och konsekvent genomförande av det experimentella protokollet, är det möjligt att nå en transfektionseffektivitet på nästan 50%. Här beskriver vi vår detaljerade protokoll för kalciumfosfattransfektion av primära hippocampus nervceller, vilka samodlades med astrogliaceller i en sandwich-format 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns flera viktiga parametrar som måste kontrolleras noggrant för konsekvent framgångsrika transfektioner 10,11. Den mest kritiska parametern för kalciumfosfat-transfektion är det pH-värde av 2x HBS, som i våra händer vanligen varierar mellan 7,10 till 7,15. Vi rekommenderar att tre partier av lager med pH-värden i 0.05 steg till svars för skillnaden mellan pH-mätare. Alternativt tillhandahåller Clontech däggdjurs transfektionskit 2x HBS som konsekvent ger god effektivitet. Tänk på att pH-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av NIH bidrag NS065183 och startmedel från Rutgers Robert Wood Johnson Medical School.
Materials
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | straight / sharp 8.5 cm |
| Vannas-Tubinger spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-14 | blunt / 14.5 cm |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-225-06 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| 100 mM Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4385 | |
| 1 M HEPES, pH 7.3 | Gibco/Invitrogen | 15630-080 | |
| GlutaMAX | Gibco/Invitrogen | 35050-061 | |
| Neurobasal Media | Gibco/Invitrogen | 21130-049 | |
| B27 Supplement (50x) | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 Supplement | Gibco/Invitrogen | 17502-048 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Invitrogen | 15070-063 | |
| 2.5% Trypsin | Gibco/Invitrogen | 15090-046 | |
| DNase I | Sigma | DN-25 | |
| Cytosine arabinoside | Calbiochem/EMD Millipore | 251010 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 |
References
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
- Zeitelhofer, M., et al. High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection. Nat. Protoc. 2, 1692-1704 (2007).
- Janas, J., Skowronski, J., Van Aelst, L. Lentiviral delivery of RNAi in hippocampal neurons. Method Enzymol. 406, 593-605 (2006).
- Graham, F. L., vander Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52, 456-467 (1973).
- Craig, A. M., Banker, G. a. G. K. Transfecting cultured neurons. Culturing Nerve Cells. , (1998).
- Alavian, K. N., et al. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13, 1224-1233 (2011).
- Zhang, Y., et al. Modulation of synaptic function by VAC14, a protein that regulates the phosphoinositides PI(3,5)P(2) and PI(5)P. EMBO J. 31, 3442-3456 (2012).
- Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 3, Unit 3 11 (2001).
- Goslin, K. A. H., Banker, G., Banker, G. a. G. K. Rat Hippocampal Neurons in Low-Density Culture. Culturing Nerve Cells. , (1998).
- Kohrmann, M., et al. Fast, convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. J. Neurosci. Res. 58, 831-835 (1999).
- Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).
- Goetze, B., Grunewald, B., Baldassa, S., Kiebler, M. Chemically controlled formation of a DNA/calcium phosphate coprecipitate: application for transfection of mature hippocampal neurons. J. Neurobiol. 60, 517-525 (2004).
