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Abstract
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Immunology and Infection

In vitro Coculture Assay zur Bewertung pathogeninduzierter Neutrophiler Transepithelmigration

Published: January 06, 2014
doi:
10.3791/50823
, , ,
1Department of Pediatrics,Harvard Medical School, 2Department of Pediatric Gastroenterology,MGH for Children, 3Mucosal Immunology and Biology Research Center,Massachusetts General Hospital

Summary

Neutrophile transepitheliale Migration als Reaktion auf eine mukosasale bakterielle Infektion trägt zu Epithelverletzungen und klinischen Erkrankungen bei. Es wurde ein In-vitro-Modell entwickelt, das Erreger, menschliche Neutrophile und polarisierte menschliche Epithelzellschichten kombiniert, die auf Transwell-Filtern angebaut werden, um Untersuchungen zur Entwirrung der molekularen Mechanismen zu erleichtern, die dieses Phänomen orchestrieren.

Abstract

Schleimhautoberflächen dienen als Schutzbarrieren gegen pathogene Organismen. Angeborene Immunantworten werden bei der Erfassung von Krankheitserregern aktiviert, die zur Infiltration von Geweben mit wandernden Entzündungszellen führen, in erster Linie Neutrophilen. Dieser Prozess hat das Potenzial, gewebezerstörend zu sein, wenn er übermäßig ist oder in einem ungelösten Zustand gehalten wird.  Cokultivierte In-vitro-Modelle können verwendet werden, um die einzigartigen molekularen Mechanismen zu untersuchen, die an pathogenerinduzierter neutrophiler transepitheliale Migration beteiligt sind. Diese Art von Modell bietet Vielseitigkeit im experimentellen Design mit der Möglichkeit für die kontrollierte Manipulation des Erregers, Epithelbarriere, oder Neutrophil. Die pathogene Infektion der apikalen Oberfläche polarisierter Epithelmonolayer, die auf durchlässigen Transwellfiltern angebaut werden, löst physiologisch relevante basolaterale zu apikale transepitheliale Migration von Neutrophilen aus, die auf die basolaterale Oberfläche aufgetragen werden. Das hier beschriebene In-vitro-Modell zeigt die verschiedenen Schritte, die zum Nachweis der neutrophilen Migration über eine polarisierte Lungenepithelmonoschicht erforderlich sind, die mit der pathogenen P. aeruginosa (PAO1) infiziert ist. Die Aussaat und Kultivierung durchlässiger Transwells mit menschlichen Lungenepithelzellen wird beschrieben, zusammen mit der Isolierung von Neutrophilen aus ganzem menschlichen Blut und der Kultivierung von PAO1 und nichtpathogenem K12 E. coli (MC1000).  Der Emigrationsprozess und die quantitative Analyse erfolgreich migrierter Neutrophilen, die als Reaktion auf pathogene Infektionen mobilisiert wurden, werden mit repräsentativen Daten, einschließlich positiver und negativer Kontrollen, dargestellt. Dieses In-vitro-Modellsystem kann manipuliert und auf andere Schleimhautoberflächen aufgebracht werden. Entzündungsreaktionen, die eine übermäßige neutrophile Infiltration beinhalten, können zerstörerisch für Wirtsgewebe sein und können ohne pathogene Infektionen auftreten. Ein besseres Verständnis der molekularen Mechanismen, die die neutrophile transepitheliale Migration durch experimentelle Manipulation des hier beschriebenen In-vitro-Kokultur-Assay-Systems fördern, hat ein erhebliches Potenzial, neue therapeutische Ziele für eine Reihe von mukosalen infektiösen sowie entzündlichen Erkrankungen zu identifizieren.

Introduction

Schleimhautoberflächen dienen als physikalische und immunologische Barrieren, die Schutz vor äußeren Bedrohungen bieten, die in der Umwelt allgegenwärtig sind1,2. Diese schützende Epithelbarriere kann beeinträchtigt werden, wenn pathogene Organismen in2eindringen. Im Falle eines bakteriellen Erregers löst diese Begegnung oft einen entzündlichen Prozess aus, indem sie das angeborene Immunsystem aktiviert und eine schnelle Mobilisierung von First Responder-Granulozyten, bekannt als Neutrophile2-4,auslöst. Chemotaktische Wirkstoffe, die die Neutrophilenrekrutierung erleichtern, werden zum Teil von den Mukosalepithelzellen produziert, die versuchen, den Wirt von dem beleidigenden Erreger2-4zu befreien. Übermäßige oder ungelöste neutrophile Infiltration der Schleimhautepitheloberfläche kann eine signifikante Pathologie verursachen1,5. Dies ist eine Folge von unspezifischen Gewebeschäden, die durch das antibakterielle Neutrophilenarsenal5-7verursacht werden. In solchen Fällen wird die bakterielle Clearance-Kapazität von Neutrophilen durch die Zerstörung des Wirtsgewebes während einer infektiösen Beleidigung überschattet.  Eine Störung der funktionalen Epithelbarriere kann zu einer verstärkten Exposition des darunter liegenden Gewebes gegenüber Mikroorganismen und/oder Toxinen führen und die Krankheitspathologie weiter verschlimmeren8,9. Diese Folgen können in mehreren Organsystemen einschließlich der Lunge und des Verdauungstraktes beobachtet werden1,5. Darüber hinaus sind nichtinfektiöse entzündliche Erkrankungen wie schwere Asthmaanfälle, chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD), akutes Atemnotsyndrom (ARDS) und entzündliche Darmerkrankungen (IBD) durch den pathologischen Bruch der Schleimhautepithelbarriere durch eine übermäßige neutrophile Reaktion4,5,10-12gekennzeichnet.

Der komplexe Prozess der Neutrophilenrekrutierung nach einer Schleimhautinfektion umfasst mehrere abgeschottete Schritte1,5,13,14. Zunächst müssen Neutrophile über eine Reihe von Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen, die die transendotheliale Migration erleichtern, aus dem Kreislauf abweichen1,13. Neutrophile navigieren als nächstes durch den vorhandenen interstitiellen Raum, der die extrazelluläre Matrix1,14enthält. Um das Lumen der infizierten Schleimhaut zu erreichen, müssen Neutrophile dann über die Epithelbarriere1,4,5wandern. Dieses komplizierte multistep Phänomen wird oft aggregiert mit in vivo Tiermodelle der Infektion15untersucht. Solche Modelle sind nützlich, um die Notwendigkeit spezifischer Faktoren wie Chemokine, Adhäsionsmoleküle oder Signalwege zu ermitteln, die am Gesamtprozess beteiligt sind, aber weitgehend unzureichend sind, um molekulare Beiträge zu lösen, die für jeden einzelnen unterteilten Schritt kritisch sind16. Cokultivierte In-vitro-Systeme, die trans-endotheliale, transmatrix- oder transepitheliale Migration von Neutrophilen modellieren, waren in dieser Hinsicht besonders nützlich1,14,16,17.

Ein robustes Cokultur-Assay-System wurde entwickelt, um Mechanismen zu entschlüsseln, die für die neutrophile transepitheliale Migration als Reaktion auf pathogene Infektionen verantwortlich sind18-22. Dieses Modell beinhaltet die Infektion der apikalen Oberfläche polarisierter menschlicher Epithelzellschichten mit einem bakteriellen Erreger, gefolgt von der Anwendung frisch isolierter menschlicher Neutrophile auf die basolaterale Oberfläche18-22. Neutrophile wandern über die Epithelbarriere als Reaktion auf epitheliale chemotaktische Produkte, die nach pathogener Infektion18,21-23sezerniert wurden. Dieses Modellsystem wurde mit Darm- und Lungenepithelkulturen eingesetzt, die geeigneten gewebespezifischen bakteriellen Krankheitserregern ausgesetzt sind, und hat neuartige molekulare Mechanismen enthüllt, die für den Neutrophilenrekrutierungsprozess während einer Schleimhautinfektion wichtig sind3,8,19,24-28. Die Stärke dieses In-vitro-Kokulturmodells besteht darin, dass ein reduktionistischer Ansatz es dem Forscher ermöglicht, den Erreger, die Epithelbarriere und/oder neutrophile in einem gut kontrollierten, hochreproduzierbaren, ziemlich preiswerten System experimentell zu manipulieren. Die aus diesem Ansatz gewonnenen Erkenntnisse können effektiv genutzt werden, um eine fokussierte Analyse von kompartumlierten Ereignissen während der Neutrophilenrekrutierung mit In-vivo-Infektionsmodellen 22,29,30durchzuführen.

Dieser Artikel zeigt die verschiedenen Schritte, die für die erfolgreiche Etablierung dieses reproduzierbaren Modells erforderlich sind, um pathogene induzierte neutrophile transepitheliale Migration zu erforschen. Lungenepithelbarrieren, die mit dem Erreger Pseudomonas aeruginosa infiziert sind, sind in diesem Artikel enthalten; andere Gewebeepithelien und Krankheitserreger können jedoch durch geringfügige Modifikationen ersetzt werden. Die Aussaat und Kultivierung polarisierter Lungenepithelzellschichten auf invertierten kollagenbeschichteten durchlässigen Transwellfiltern wird hierin detailliert beschrieben, ebenso wie das Wachstum der pathogenen P. aeruginosa und die Isolierung von Neutrophilen aus Vollblut. Wie diese Komponenten kombiniert werden, um pathogeninduzierte neutrophile transepitheliale Migration zu beobachten, wird zusammen mit geeigneten positiven und negativen Kontrollen vorgestellt, um einen reproduzierbaren Assay zu etablieren. Die Vielseitigkeit dieses Ansatzes zur Untersuchung verschiedener Aspekte der pathogenen induzierten neutrophilen transepitheliale Migration wird unter Bezugnahme auf spezifische Studien in der Literatur diskutiert.

Protocol

Die Schritte (1-3) sollten in einer sterilen Umgebung unter einer laminaren Durchflusshaube durchgeführt werden. 1. Kollagenbeschichtung Transwells Machen Sie eine 30 g/ml Kollagenlösung. Verdünnen Sie 3 mg/ml Kollagenbestand 1:100 in 60% Ethanol, das durch eine 0,2 m Filtereinheit geleitet wurde. Vortex verdünnt 30 g/ml Lösung. Hinweis: Es ist nicht notwendig, die 3 mg/ml Kollagen-Stammlösung zu wirbeln, da diese Lösung recht zähflüssig ist und Luftblase…

Representative Results

Mehrere Studien haben gezeigt, dass pathogeninfizierte Epithelschichten die neutrophile transepitheliale Migration erleichtern3,8,19,24-28,31,32. Dies geschieht über eine pathogen-spezifische Induktion eines epitheliaalzellabgeleiteten neutrophilen chemotaktischen Gradienten3,23. Zum Beispiel bewirkt die pathogene P. aeruginosa, die mit der apikalen Oberfläche von Lungenepithelzellen interagiert, dass eine beträchtliche Anzahl von Neutrophilen über die Epithelschicht18,22,25,26,33,…

Discussion

Neutrophile Migration über Schleimhautepitheloberflächen ist ein häufiges Merkmal in der Krankheitspathologie nach einer Infektion mit bakteriellen Krankheitserregern3. Die hier beschriebene Methode bietet einen schnellen, einfachen Ansatz, um dieses diskrete Ereignis experimentell zu isolieren, indem ein menschliches In-vitro-Kokultur-Assay-System verwendet wird, das ein Merkmal des entzündlichen Prozesses modelliert, der durch bakterielle Infektionen ausgelöst wird. Dieses System wurde ursprü…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von NIH (1 R01 AI095338-01A1) finanziell unterstützt.

Materials

NCl-H292 cells ATCC CRL-1848
RPMI-1640 medium ATCC 30-2001
Pseudomonas aeruginosa PAO1 ATCC #47085
Escherichia coli MC1000 ATCC #39531
D-PBS (1x) liquid Invitrogen 14190-144 without calcium and magnesium
Heat Inactivated Fetal bovine serum Invitrogen 10082-147 10% added to culture medium
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140-122 100x: 10,000 units of penicillin and 10,000 µg of streptomycin per ml.
Trypsin-EDTA (0.05%) Invitrogen 25300-062 50 ml aliquots are stored frozen at -20 ºC.  Aliquot in use can be stored at 4 ºC short-term.  
Hank's Balanced Salt Solution – HBSS(-) Invitrogen 14175-079 Sterile, without calcium and magnesium
Trypan Blue Solution Invitrogen 15250-061. Stock = 0.4%
Collagen, Rat Tail Invitrogen A10483-01 Can also be isolated in the laboratory directly from the tails of rats using standard protocols
Citric acid Sigma-Aldrich  C1909-500G Component of 1 M citrate buffer and acid citrate dextrose (ACD) solution
Sodium Citrate Sigma-Aldrich  S4641-500G Component of 1 M citrate buffer
Dextrose anhydrous Sigma-Aldrich  D8066-250G Component of acid citrate dextrose (ACD) solution
Ammonium Chloride Sigma-Aldrich  213330-500G Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich  S6014-500G Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
EDTA Sigma-Aldrich  ED-100G Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
HBSS(+) powder Sigma-Aldrich  H1387-10L Key component of HBSS+
HEPES Sigma-Aldrich  H3375-500G Component of HBSS+
Sigmacote Sigma-Aldrich  SL2-25ML Follow vendor instructions to coat glass pipette tips
Triton X-100 Sigma-Aldrich  T-9284
2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) Sigma-Aldrich  A9941-50TAB Key component of ABTS substrate solution
30% Hydrogen Peroxide Solution Sigma-Aldrich  H1009-100ML Component of ABTS substrate solution
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP or fMLF) Sigma-Aldrich  F-3506 A Stock solution of 10 mM in DMSO should be prepared and aliquots stored at -20 ºC.
Gelatin Type B Fisher Scientific M-12026
Pseudomonas isolation agar  Fisher Scientific DF0927-17-1 Follow manufacturer’s instructions to make PIA plates
Ficoll-Paque PLUS  Fisher Scientific 45-001-749 Optional, can improve neutrophil purity
Name of Material / Equipment Company Catalog Number Comments
24-well migration plate Corning Incorporated #3524
24-well wash plate Falcon 35-1147 Can be reused if soaked in 70% ethanol and washed thoroughly prior to reuse
96-well plate Fisher Scientific #12565501
Transwell Permeable Supports  Corning Incorporated #3415 Polycarbonate; Diameter: 6.5 mm; Growth area: 0.33 cm2; Dish style: 24-well plate; Pore size: 3.0 µm
Petri dish Falcon 35-1013 Each Petri dish holds 24 inverted 0.33 cm2 Transwells.  
500 ml 0.2 μm filter / flask Fisher Scientific 09-740-25A To sterilize acid citrate dextrose (ACD) solution
5-3/4 in glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-20A Coat tips with Sigmacote prior to use
Hemostat Fisher Scientific 13-812-14 Curved, Serrated
Invertoskop Inverted Microscope Zeiss #342222
Versa-Max Microplate Reader Molecular Devices #432789
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References

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Kusek, M. E., Pazos, M. A., Pirzai, W., Hurley, B. P. In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration. J. Vis. Exp. (83), e50823, doi:10.3791/50823 (2014).
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