JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

In vitro Coculture Assay для оценки патогена индуцированной нейтрофил трансэпителиальной миграции

Published: January 06, 2014
doi:
10.3791/50823
, , ,
1Department of Pediatrics,Harvard Medical School, 2Department of Pediatric Gastroenterology,MGH for Children, 3Mucosal Immunology and Biology Research Center,Massachusetts General Hospital

Summary

Нейтрофиловая трансэпителиальная миграция в ответ на мукосал бактериальную инфекцию способствует эпителиальной травме и клиническим заболеваниям. В пробирке была разработана модель, которая сочетает в себе патоген, нейтрофилов человека, и поляризованных слоев эпителиальных клеток человека, выращенных на трансуэлл фильтры для облегчения исследований к распутыванию молекулярных механизмов организации этого явления.

Abstract

Слизистые поверхности служат защитными барьерами против патогенных организмов. Врожденные иммунные реакции активируются при зондировании патогена, что приводит к проникновению тканей с мигрирующими воспалительными клетками, в первую очередь нейтрофилами. Этот процесс может быть разрушительным для тканей, если чрезмерным или провел в нерешенном состоянии.  Кокультурные модели in vitro могут быть использованы для изучения уникальных молекулярных механизмов, участвующих в патогенной индуцированной нейтрофиловой трансэпителиальной миграции. Этот тип модели обеспечивает универсальность в экспериментальном дизайне с возможностью контролируемых манипуляций с патогеном, эпителиальным барьером или нейтрофилом. Патогенная инфекция апической поверхности поляризованных эпителиальных монослой, выращенных на проницаемых трансвелловых фильтрах, провоцирует физиологически релевантную базолатерную к апикалиальной трансэпителиальной миграции нейтрофилов, применяемых к базолатеральной поверхности. Описанная в настоящем времени модель in vitro демонстрирует многочисленные шаги, необходимые для демонстрации миграции нейтрофилов через поляризованный эпителиальный монослой легких, который был заражен патогенной P. aeruginosa (PAO1). Описано посев и культивирование проницаемых трансвеллов с эпителиальными клетками легких человека, а также изоляция нейтрофилов от всей человеческой крови и культивирование ПАО1 и непатогенной кишечной палочки K12 (MC1000).  Процесс эмиграции и количественный анализ успешно мигрировавших нейтрофилов, мобилизованных в ответ на патогенную инфекцию, показаны на основе репрезентативных данных, включая положительный и отрицательный контроль. Эта модельная система in vitro может быть использована и применена к другим слизистой поверхности. Воспалительные реакции, которые связаны с чрезмерным проникновением нейтрофилов, могут быть разрушительными для тканей организма и могут возникать при отсутствии патогенных инфекций. Лучшее понимание молекулярных механизмов, которые способствуют нейтрофиловой трансэпителиальной миграции путем экспериментальных манипуляций с системой анализа культуры in vitro, описанной в настоящем, имеет значительный потенциал для выявления новых терапевтических целей для целого ряда слизистых инфекционных, а также воспалительных заболеваний.

Introduction

Слизистые поверхности служат физическими и иммунологическими барьерами, обеспечивающими защиту от внешних угроз, широко распространенных вокружающей среде 1,2. Этот защитный эпителиальный барьер может быть скомпрометирован, когда патогенные организмы вторгаются2. В случае бактериального патогена, эта встреча часто провоцирует воспалительный процесс, активируя врожденную иммунную систему и вызывая быструю мобилизацию гранулоцитов первого реагирования, известных какнейтрофилов 2-4. Химиотатические агенты, облегчающие набор нейтрофилов, частично вырабатываются слизистыми эпителиальными клетками, стремящихся избавить хозяина отпатогена-нарушителя 2-4. Чрезмерное или неразрешеное нейтрофиловое проникновение слизистой оболочки эпителиальной поверхности может вызватьзначительную патологию 1,5. Это следствие неспецифического повреждения тканей, вызванного антибактериальным нейтрофиловым арсеналом5-7. В таких случаях бактериальная клиренсная способность нейтрофилов омрачается разрушением тканей хозяина во время инфекционного оскорбления.  Нарушение функции защитного эпителиального барьера может привести к усилению воздействия основных тканей на микроорганизмы и/или токсины, еще больше усугубивпатологию заболевания 8,9. Эти последствия можно наблюдать в нескольких системах органов, включая легкие и пищеварительныйтракт 1,5. Кроме того, неинфекционные воспалительные заболевания, такие как тяжелые приступы астмы, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), острый респираторный дистресс-синдром (ARDS) и воспалительные заболевания кишечника (IBD) отмечены патологическим нарушением слизистой эпителиального барьера чрезмерным нейтрофилическимответом 4,5,10-12.

Сложный процесс набора нейтрофилов после слизистой инфекции включает в себя несколько разрозненныхшагов 1,5,13,14. Во-первых, нейтрофиловы должны отойти от циркуляции через ряд взаимодействия клетки с клеткой к клетке, которые облегчают транс-эндотелиальноймиграции 1,13. Нейтрофилов далее перемещаться существующих интерстициального пространства, содержащего внеклеточнойматрицы 1,14. Чтобы достичь люмена инфицированной слизистой оболочки, нейтрофилов должны затем мигрировать черезэпителиальный барьер 1,4,5. Это сложное многоступенчатое явление часто расследуется в совокупности с использованием in vivo животных моделейинфекции 15. Такие модели полезны для установления необходимости конкретных факторов, таких как хемокины, молекулы адгезии, или сигнальные пути, которые участвуют в общем процессе, но в значительной степени недостаточны для решения молекулярных взносов, критически важных для каждого отдельного разобщеногошага 16. Кокультурные системы in vitro, моделируемые транс-эндотелиальные, транс-матрицы, или трансэпителиальной миграции нейтрофилов были особеннополезны в этом отношении 1,14,16,17.

Для расшифровки механизмов, ответственных за нейтрофиловую трансэпителиаловую миграцию в ответ на патогеннуюинфекцию 18-22, разработананадежная система анализа кокультуры. Эта модель включает в себя заражение апической поверхности поляризованных слоев эпителиальных клеток человека бактериальным патогеном с последующим применением свежеиспеченные человеческие нейтрофилы на базолатеральнойповерхности 18-22. Нейтрофилов мигрировать через эпителиальный барьер в ответ на эпителиальные производные химиотатические продукты, выделяется послепатогенной инфекции 18,21-23. Эта модельная система была использована с использованием кишечных и легких эпителиальных культур, подверженных соответствующим тканей конкретных бактериальных патогенов и обнародовал новые молекулярные механизмы, вероятно, важное значение для процесса набора нейтрофиловво время слизистой инфекции 3,8,19,24-28. Сила этой модели совместной культуры in vitro заключается в том, что дрениционистский подход позволяет исследователю экспериментально манипулировать патогеном, эпителиальным барьером и/или нейтрофилом в хорошо контролируемой, высокоразвумной, довольно недорогой системе. Insight, собранные из этого подхода могут быть эффективно использованы для проведения целенаправленного анализа разрозненных событий во время набора нейтрофилов с использованием in vivo инфекции модели 22,29,30.

Эта статья демонстрирует многочисленные шаги, необходимые для успешного создания этой воспроизводимой модели для изучения патогена индуцированной нейтрофиловой трансэпителиальной миграции. Эпителиальные барьеры легких, инфицированные патогеном Pseudomonas aeruginosa, представлены в данной статье; однако, другие эпителии тканей и патогенных микроорганизмов могут быть заменены незначительными изменениями. Посев и культивирование поляризованных слоев эпителиальных клеток легких на перевернутых коллагеновых проницаемых трансуэлловых фильтрах подробно описано в настоящем, как и рост патогенных P. aeruginosa и изоляция нейтрофилов от всей крови. Как эти компоненты объединяются для наблюдения патогена индуцированной нейтрофиловой трансэпителиальной миграции представлен вместе с соответствующими положительными и отрицательными контроля для создания воспроизводимых анализ. Универсальность этого подхода для изучения различных аспектов патогенной индуцированной нейтрофиловой трансэпителиальной миграции обсуждается со ссылкой на конкретные исследования в литературе.

Protocol

Шаги (1-3) должны выполняться в стерильной среде под капотом ламинарного потока. 1. Коллагеновое покрытие трансвеллов Сделайте раствор коллагена 30 мкг/мл. Разбавить 3 мг/мл коллагенового бульона 1:100 в 60% этанола, который был пройден через блок фильтра 0,2 мкм. В…

Representative Results

Несколько исследований показали, что патогенные эпителиальные слои облегчают нейтрофиловую трансэпителиаловуюмиграцию 3,8,19,24-28,31,32. Это происходит через патоген-специфической индукции эпителиальных клеток полученных нейтрофилов хемотаксического градиента3,23. Например, п…

Discussion

Миграция нейтрофилов через слизистые эпителиальные поверхности является общей чертой в патологии заболеваний после заражения бактериальными патогенами3. Методология, описанная в настоящем, предлагает быстрый, простой подход к экспериментальной изоляции этого дискретного соб?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана финансово NIH (1 R01 AI095338-01A1).

Materials

NCl-H292 cells ATCC CRL-1848
RPMI-1640 medium ATCC 30-2001
Pseudomonas aeruginosa PAO1 ATCC #47085
Escherichia coli MC1000 ATCC #39531
D-PBS (1x) liquid Invitrogen 14190-144 without calcium and magnesium
Heat Inactivated Fetal bovine serum Invitrogen 10082-147 10% added to culture medium
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140-122 100x: 10,000 units of penicillin and 10,000 µg of streptomycin per ml.
Trypsin-EDTA (0.05%) Invitrogen 25300-062 50 ml aliquots are stored frozen at -20 ºC.  Aliquot in use can be stored at 4 ºC short-term.  
Hank's Balanced Salt Solution – HBSS(-) Invitrogen 14175-079 Sterile, without calcium and magnesium
Trypan Blue Solution Invitrogen 15250-061. Stock = 0.4%
Collagen, Rat Tail Invitrogen A10483-01 Can also be isolated in the laboratory directly from the tails of rats using standard protocols
Citric acid Sigma-Aldrich  C1909-500G Component of 1 M citrate buffer and acid citrate dextrose (ACD) solution
Sodium Citrate Sigma-Aldrich  S4641-500G Component of 1 M citrate buffer
Dextrose anhydrous Sigma-Aldrich  D8066-250G Component of acid citrate dextrose (ACD) solution
Ammonium Chloride Sigma-Aldrich  213330-500G Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich  S6014-500G Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
EDTA Sigma-Aldrich  ED-100G Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
HBSS(+) powder Sigma-Aldrich  H1387-10L Key component of HBSS+
HEPES Sigma-Aldrich  H3375-500G Component of HBSS+
Sigmacote Sigma-Aldrich  SL2-25ML Follow vendor instructions to coat glass pipette tips
Triton X-100 Sigma-Aldrich  T-9284
2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) Sigma-Aldrich  A9941-50TAB Key component of ABTS substrate solution
30% Hydrogen Peroxide Solution Sigma-Aldrich  H1009-100ML Component of ABTS substrate solution
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP or fMLF) Sigma-Aldrich  F-3506 A Stock solution of 10 mM in DMSO should be prepared and aliquots stored at -20 ºC.
Gelatin Type B Fisher Scientific M-12026
Pseudomonas isolation agar  Fisher Scientific DF0927-17-1 Follow manufacturer’s instructions to make PIA plates
Ficoll-Paque PLUS  Fisher Scientific 45-001-749 Optional, can improve neutrophil purity
Name of Material / Equipment Company Catalog Number Comments
24-well migration plate Corning Incorporated #3524
24-well wash plate Falcon 35-1147 Can be reused if soaked in 70% ethanol and washed thoroughly prior to reuse
96-well plate Fisher Scientific #12565501
Transwell Permeable Supports  Corning Incorporated #3415 Polycarbonate; Diameter: 6.5 mm; Growth area: 0.33 cm2; Dish style: 24-well plate; Pore size: 3.0 µm
Petri dish Falcon 35-1013 Each Petri dish holds 24 inverted 0.33 cm2 Transwells.  
500 ml 0.2 μm filter / flask Fisher Scientific 09-740-25A To sterilize acid citrate dextrose (ACD) solution
5-3/4 in glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-20A Coat tips with Sigmacote prior to use
Hemostat Fisher Scientific 13-812-14 Curved, Serrated
Invertoskop Inverted Microscope Zeiss #342222
Versa-Max Microplate Reader Molecular Devices #432789
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Burns, A. R., Smith, C. W., Walker, D. C. Unique structural features that influence neutrophil emigration into the lung. Physiol. Rev. 83, 309-336 (2003).
  2. Hurley, B. P., McCormick, B. A. Intestinal epithelial defense systems protect against bacterial threats. Curr. Gastroenterol. Rep. 6, 355-361 (2004).
  3. McCormick, B. A. Bacterial-induced hepoxilin A3 secretion as a pro-inflammatory mediator. FEBS J. 274, 3513-3518 (2007).
  4. Mumy, K. L., McCormick, B. A. The role of neutrophils in the event of intestinal inflammation. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 697-701 (2009).
  5. Chin, A. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury. Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).
  6. Segel, G. B., Halterman, M. W., Lichtman, M. A. The paradox of the neutrophil’s role in tissue injury. J. Leukoc. Biol. 89, 359-372 (2011).
  7. Weiss, S. J. Tissue destruction by neutrophils. N. Engl. J. Med. 320, 365-376 (1989).
  8. Hurley, B. P., Thorpe, C. M., Acheson, D. W. Shiga toxin translocation across intestinal epithelial cells is enhanced by neutrophil transmigration. Infect. Immun. 69, 6148-6155 (2001).
  9. Kohler, H., et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium regulates intercellular junction proteins and facilitates transepithelial neutrophil and bacterial passage. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 293, 178-187 (2007).
  10. Gane, J., Stockley, R. Mechanisms of neutrophil transmigration across the vascular endothelium in COPD. Thorax. 67, 553-561 (2012).
  11. Grommes, J., Soehnlein, O. Contribution of neutrophils to acute lung injury. Mol. Med. 17, 293-307 (2011).
  12. Nakagome, K., Matsushita, S., Nagata, M. Neutrophilic inflammation in severe asthma. Int. Arch. Allergy Immunol.. 158 Suppl 1, 96-102 (2012).
  13. Choi, E. Y., Santoso, S., Chavakis, T. Mechanisms of neutrophil transendothelial migration. Front. Biosci. 14, 1596-1605 (2009).
  14. Louis, N. A., Campbell, E., Colgan, S. P. Model systems to investigate neutrophil adhesion and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 412, 257-270 (2007).
  15. Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia. Infect. Immun. 77, 568-575 (2009).
  16. Hurley, B. P., McCormick, B. A. Translating tissue culture results into animal models: the case of Salmonella typhimurium. Trends Microbiol. 11, 562-569 (2003).
  17. Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. In vitro neutrophil transepithelial migration. Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).
  18. Hurley, B. P., Siccardi, D., Mrsny, R. J., McCormick, B. A. Polymorphonuclear cell transmigration induced by Pseudomonas aeruginosa requires the eicosanoid hepoxilin A3. J. Immunol. 173, 5712-5720 (2004).
  19. McCormick, B. A., Colgan, S. P., Delp-Archer, C., Miller, S. I., Madara, J. L. Salmonella typhimurium attachment to human intestinal epithelial monolayers: transcellular signalling to subepithelial neutrophils. J. Cell Biol. 123, 895-907 (1993).
  20. McCormick, B. A., et al. Surface attachment of Salmonella typhimurium to intestinal epithelia imprints the subepithelial matrix with gradients chemotactic for neutrophils. J. Cell Biol. 131, 1599-1608 (1995).
  21. Mrsny, R. J., et al. Identification of hepoxilin A3 in inflammatory events: a required role in neutrophil migration across intestinal epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7421-7426 (2004).
  22. Tamang, D. L., et al. Hepoxilin A(3) facilitates neutrophilic breach of lipoxygenase-expressing airway epithelial barriers. J. Immunol. 189, 4960-4969 (2012).
  23. McCormick, B. A., Parkos, C. A., Colgan, S. P., Carnes, D. K., Madara, J. L. Apical secretion of a pathogen-elicited epithelial chemoattractant activity in response to surface colonization of intestinal epithelia by Salmonella typhimurium. J. Immunol. 160, 455-466 (1998).
  24. Boll, E. J., et al. Enteroaggregative Escherichia coli promotes transepithelial migration of neutrophils through a conserved 12-lipoxygenase pathway. Cell Microbiol. 14, 120-132 (2012).
  25. Hurley, B. P., et al. The two-component sensor response regulator RoxS/RoxR plays a role in Pseudomonas aeruginosa interactions with airway epithelial cells. Microbes Infect. 12, 190-198 (2010).
  26. Hurley, B. P., Williams, N. L., McCormick, B. A. Involvement of phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-mediated PMN transepithelial migration. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 290, L703-L709 (2006).
  27. McCormick, B. A., Siber, A. M., Maurelli, A. T. Requirement of the Shigella flexneri virulence plasmid in the ability to induce trafficking of neutrophils across polarized monolayers of the intestinal epithelium. Infect. Immun. 66, 4237-4243 (1998).
  28. Savkovic, S. D., Koutsouris, A., Hecht, G. Attachment of a noninvasive enteric pathogen, enteropathogenic Escherichia coli, to cultured human intestinal epithelial monolayers induces transmigration of neutrophils. Infect. Immun. 64, 4480-4487 (1996).
  29. Agbor, T. A., Demma, Z. C., Mumy, K. L., Bien, J. D., McCormick, B. A. The ERM protein, ezrin, regulates neutrophil transmigration by modulating the apical localization of MRP2 in response to the SipA effector protein during Salmonella typhimurium infection. Cell Microbiol. 13, 2007-2021 (2011).
  30. Pazos, M., et al. Multidrug resistance-associated transporter 2 regulates mucosal inflammation by facilitating the synthesis of hepoxilin A3. J. Immunol. 181, 8044-8052 (2008).
  31. Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism. Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).
  32. Bhowmick, R., et al. Systemic Disease during Streptococcus pneumoniae Acute Lung Infection Requires 12-Lipoxygenase-Dependent Inflammation. J. Immunol. , (2013).
  33. Hurley, B. P., Pirzai, W., Mumy, K. L., Gronert, K., McCormick, B. A. Selective eicosanoid-generating capacity of cytoplasmic phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-infected epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 300, 286-294 (2011).
  34. Hurley, B. P., Sin, A., McCormick, B. A. Adhesion molecules involved in hepoxilin A3-mediated neutrophil transepithelial migration. Clin. Exp. Immunol. 151, 297-305 (2008).
  35. Frank, D. W. Research Topic on Pseudomonas aeruginosa, Biology, Genetics, and Host-Pathogen Interactions.. Front. Microbiol. 3, 20 (2012).
  36. Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Lung infections associated with cystic fibrosis. Clin. Microbiol. Rev. 15, 194-222 (2002).
  37. Bucior, I., Mostov, K., Engel, J. N. Pseudomonas aeruginosa-mediated damage requires distinct receptors at the apical and basolateral surfaces of the polarized epithelium. Infect. Immun. 78, 939-953 (2010).
  38. Kierbel, A., et al. Pseudomonas aeruginosa exploits a PIP3-dependent pathway to transform apical into basolateral membrane. J. Cell Biol. 177, 21-27 (2007).
  39. Lee, C. A., et al. A secreted Salmonella protein induces a proinflammatory response in epithelial cells, which promotes neutrophil migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12283-12288 (2000).
  40. Zurawski, D. V., Mumy, K. L., Faherty, C. S., McCormick, B. A., Maurelli, A. T. Shigella flexneri type III secretion system effectors OspB and OspF target the nucleus to downregulate the host inflammatory response via interactions with retinoblastoma protein. Mol. Microbiol. 71, 350-368 (2009).
  41. Brazil, J. C., et al. Neutrophil migration across intestinal epithelium: evidence for a role of CD44 in regulating detachment of migrating cells from the luminal surface. J. Immunol. 185, 7026-7036 (2010).
  42. Lawrence, D. W., et al. Antiadhesive role of apical decay-accelerating factor (CD55) in human neutrophil transmigration across mucosal epithelia. J. Exp. Med. 198, 999-1010 (2003).
  43. Hodges, K., Hecht, G. Interspecies communication in the gut, from bacterial delivery to host-cell response. J. Physiol. 590, 433-440 (2012).

Tags

Keywords: In Vitro CocultureNeutrophil Trans-epithelial MigrationMucosal ImmunityPathogenic InfectionPolarized Epithelial MonolayerNeutrophil InfiltrationInflammatory ResponseTherapeutic Targets
check_url/50823?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Kusek, M. E., Pazos, M. A., Pirzai, W., Hurley, B. P. In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration. J. Vis. Exp. (83), e50823, doi:10.3791/50823 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image