In vitro Ensayo de cocultivo para evaluar la migración transepitelial de neutrófilos inducida por patógenos
Summary
La migración transepitelial del neutrófilo en respuesta a la infección bacteriana de la mucosa contribuye a lesión epitelial y a la enfermedad clínica. Se ha desarrollado un modelo in vitro que combina patógenos, neutrófilos humanos y capas polarizadas de células epiteliales humanas cultivadas en filtros transwell para facilitar las investigaciones hacia el desentrañamiento de los mecanismos moleculares que orquestan este fenómeno.
Abstract
Las superficies mucosas sirven como barreras protectoras contra organismos patógenos. Las respuestas inmunitarias innatas se activan al detectar patógenos que conducen a la infiltración de tejidos con células inflamatorias migratorias, principalmente neutrófilos. Este proceso tiene el potencial de ser destructivo para los tejidos si es excesivo o se mantiene en un estado no resuelto. Los modelos ines vitro cocultivos se pueden utilizar para estudiar los mecanismos moleculares únicos implicados en la migración transepitelial inducida por patógenos neutrófilos. Este tipo de modelo proporciona versatilidad en el diseño experimental con la oportunidad de manipulación controlada del patógeno, barrera epitelial o neutrófilo. La infección patógena de la superficie apical de monocapas epiteliales polarizadas crecidas en los filtros permeables del transwell instiga la migración basolateral a apical fisiológico relevante del transporte-epitelial de neutrófilos aplicados a la superficie basolateral. El modelo in vitro descrito en este documento demuestra los múltiples pasos necesarios para demostrar la migración de neutrófilos a través de una monocapa epitelial pulmonar polarizada que ha sido infectada con patógeno p. aeruginosa (PAO1). La siembra y el cultivo de transwells permeables con las células epiteliales derivadas humanas del pulmón se describen, junto con el aislamiento de neutrófilos de sangre humana entera y el cultivo de PAO1 y de K12 E. coli no patógeno (MC1000). El proceso de emigración y el análisis cuantitativo de los neutrófilos migrados con éxito que se han movilizado en respuesta a la infección patógena se muestran con datos representativos, incluidos controles positivos y negativos. Este sistema modelo in vitro puede ser manipulado y aplicado a otras superficies mucosas. Las respuestas inflamatorias que implican la infiltración excesiva del neutrófilo pueden ser destructivas a los tejidos del anfitrión y pueden ocurrir en la ausencia de infecciones patógenas. Una mejor comprensión de los mecanismos moleculares que promueven la migración transepitelial del neutrófilo con la manipulación experimental del sistema in vitro del análisis del cocultivo descrito adjunto tiene potencial significativo para identificar las blancos terapéuticas nuevas para una gama de enfermedades infecciosas de la mucosa así como inflamatorias.
Introduction
Las superficies mucosas sirven como barreras físicas e inmunológicas proporcionando protección contra las amenazas externas generalizadas en el medio ambiente1,2. Esta barrera epitelial protectora puede verse comprometida cuando los organismos patógenos invaden2. En el caso de un patógeno bacteriano, este encuentro a menudo instiga un proceso inflamatorio al activar el sistema inmune innato y desencadenar una rápida movilización de granulocitos de primer respondiente conocidos como neutrófilos2-4. Los agentes quimiotácticos que facilitan el reclutamiento de neutrófilos son producidos en parte por las células epiteliales de la mucosa que buscan librar al huésped del patógeno infractor2-4. La infiltración excesiva o no resuelta de neutrófilos en la superficie epitelial de la mucosa puede causar una patología significativa1,5. Esto es una consecuencia del daño tisular inespecífico causado por el arsenal de neutrófilosantibacterianos 5-7. En tales casos, la capacidad de la separación bacteriana de neutrófilos es eclipsada por la destrucción del tejido del anfitrión durante un insulto infeccioso. La interrupción de la función de barrera epitelial protectora puede conducir a una mayor exposición del tejido subyacente a microorganismos y/o toxinas, exacerbando aún más la patología de la enfermedad8,9. Estas consecuencias se pueden observar en múltiples sistemas de órganos, incluyendo el pulmón y el tracto digestivo1,5. Además, las condiciones inflamatorias no infecciosas tales como episodios severos de asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) y enfermedad inflamatoria intestinal (EII) están marcadas por la ruptura patológica de la barrera epitelial de la mucosa por una respuesta neutrófila excesiva4,5,10-12.
El complejo proceso de reclutamiento de neutrófilos después de la infección de la mucosa implica varios pasos compartimentados1,5,13,14. En primer lugar, los neutrófilos deben salir de la circulación a través de una serie de interacciones célula a célula que faciliten la migración trans-endotelial1,13. Los neutrófilos navegan a continuación por el espacio intersticial existente que contiene la matriz extracelular1,14. Para alcanzar la luz de la mucosa infectada, los neutrófilos deben entonces migrar a través de la barrera epitelial1,4,5. Este intrincado fenómeno de varios pasos se investiga a menudo en conjunto utilizando modelos animales in vivo de infección15. Tales modelos son útiles para establecer la necesidad de factores específicos, tales como quimiocinas, moléculas de adhesión o vías de señalización que participan en el proceso general, pero son en gran medida inadecuados para resolver las contribuciones moleculares críticas para cada paso compartimentado distinto16. Los sistemas cocultivos in vitro que modelan la migración trans-endotelial, trans-matriz o transepitelial de neutrófilos han sido particularmente útiles en este sentido1,14,16,17.
Se ha desarrollado un robusto sistema de ensayo de cocultivo con el fin de descifrar los mecanismos responsables de la migración transepitelial de neutrófilos en respuesta a la infección patógena18-22. Este modelo consiste en infectar la superficie apical de las capas de células epiteliales humanas polarizadas con un patógeno bacteriano seguido de la aplicación de neutrófilos humanos recién aislados a la superficie basolateral18-22. Los neutrófilos migran a través de la barrera epitelial en respuesta a productos quimiotácticos derivados de la epitelial secretados después de una infección patógena18,21-23. Este sistema modelo se ha empleado utilizando cultivos epiteliales intestinales y pulmonares expuestos a patógenos bacterianos específicos del tejido apropiado y ha revelado nuevos mecanismos moleculares probablemente importantes para el proceso de reclutamiento de neutrófilos durante la infección de la mucosa3,8,19,24-28. La fuerza de este modelo de cocultivo in vitro es que un enfoque reduccionista permite al investigador manipular experimentalmente el patógeno, la barrera epitelial y / o neutrófilo en un sistema bien controlado, altamente reproducible y bastante barato. La información obtenida de este enfoque puede aprovecharse eficazmente para realizar análisis enfocados de eventos compartimentados durante el reclutamiento de neutrófilos utilizando modelos de infección in vivo 22,29,30.
Este artículo demuestra los pasos múltiples necesarios para el establecimiento acertado de este modelo reproducible para explorar la migración transporte-epitelial inducida patógeno del neutrófilo. Las barreras epiteliales del pulmón infectadas con el patógeno Pseudomonas aeruginosa se ofrecen en este artículo; sin embargo, otros epitelios y patógenos del tejido se pueden substituir con modificaciones de menor importancia. La siembra y el cultivo de capas polarizadas de células epiteliales pulmonares en filtros de transwell permeables recubiertos de colágeno invertido se detallan aquí, al igual que el crecimiento de P. aeruginosa patógeno y el aislamiento de neutrófilos de la sangre entera. Cómo estos componentes se combinan para observar la migración transepitelial inducida por patógenos neutrófilos se presenta junto con controles positivos y negativos apropiados para establecer un ensayo reproducible. La versatilidad de este acercamiento para examinar varios aspectos de la migración transporte-epitelial inducida patógeno del neutrófilo se discute referente a estudios específicos en la literatura.
Protocol
Representative Results
Discussion
La migración de neutrófilos a través de las superficies epiteliales de la mucosa es una característica común en la patología de la enfermedad después de la infección con patógenos bacterianos3. La metodología descrita en este documento ofrece un enfoque rápido y directo para aislar experimentalmente este evento discreto utilizando un sistema de ensayo de cocultivo in vitro derivado de células humanas que modela una característica del proceso inflamatorio desencadenado por infecciones bact…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado financieramente por los NIH (1 R01 AI095338-01A1).
Materials
| NCl-H292 cells | ATCC | CRL-1848 | |
| RPMI-1640 medium | ATCC | 30-2001 | |
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 | ATCC | #47085 | |
| Escherichia coli MC1000 | ATCC | #39531 | |
| D-PBS (1x) liquid | Invitrogen | 14190-144 | without calcium and magnesium |
| Heat Inactivated Fetal bovine serum | Invitrogen | 10082-147 | 10% added to culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 100x: 10,000 units of penicillin and 10,000 µg of streptomycin per ml. |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Invitrogen | 25300-062 | 50 ml aliquots are stored frozen at -20 ºC. Aliquot in use can be stored at 4 ºC short-term. |
| Hank's Balanced Salt Solution – HBSS(-) | Invitrogen | 14175-079 | Sterile, without calcium and magnesium |
| Trypan Blue Solution | Invitrogen | 15250-061. | Stock = 0.4% |
| Collagen, Rat Tail | Invitrogen | A10483-01 | Can also be isolated in the laboratory directly from the tails of rats using standard protocols |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C1909-500G | Component of 1 M citrate buffer and acid citrate dextrose (ACD) solution |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S4641-500G | Component of 1 M citrate buffer |
| Dextrose anhydrous | Sigma-Aldrich | D8066-250G | Component of acid citrate dextrose (ACD) solution |
| Ammonium Chloride | Sigma-Aldrich | 213330-500G | Component of red blood cell (RBC) lysis buffer |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014-500G | Component of red blood cell (RBC) lysis buffer |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED-100G | Component of red blood cell (RBC) lysis buffer |
| HBSS(+) powder | Sigma-Aldrich | H1387-10L | Key component of HBSS+ |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-500G | Component of HBSS+ |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | Follow vendor instructions to coat glass pipette tips |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) | Sigma-Aldrich | A9941-50TAB | Key component of ABTS substrate solution |
| 30% Hydrogen Peroxide Solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Component of ABTS substrate solution |
| N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP or fMLF) | Sigma-Aldrich | F-3506 | A Stock solution of 10 mM in DMSO should be prepared and aliquots stored at -20 ºC. |
| Gelatin Type B | Fisher Scientific | M-12026 | |
| Pseudomonas isolation agar | Fisher Scientific | DF0927-17-1 | Follow manufacturer’s instructions to make PIA plates |
| Ficoll-Paque PLUS | Fisher Scientific | 45-001-749 | Optional, can improve neutrophil purity |
| Name of Material / Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well migration plate | Corning Incorporated | #3524 | |
| 24-well wash plate | Falcon | 35-1147 | Can be reused if soaked in 70% ethanol and washed thoroughly prior to reuse |
| 96-well plate | Fisher Scientific | #12565501 | |
| Transwell Permeable Supports | Corning Incorporated | #3415 | Polycarbonate; Diameter: 6.5 mm; Growth area: 0.33 cm2; Dish style: 24-well plate; Pore size: 3.0 µm |
| Petri dish | Falcon | 35-1013 | Each Petri dish holds 24 inverted 0.33 cm2 Transwells. |
| 500 ml 0.2 μm filter / flask | Fisher Scientific | 09-740-25A | To sterilize acid citrate dextrose (ACD) solution |
| 5-3/4 in glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20A | Coat tips with Sigmacote prior to use |
| Hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | Curved, Serrated |
| Invertoskop Inverted Microscope | Zeiss | #342222 | |
| Versa-Max Microplate Reader | Molecular Devices | #432789 |
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