Organel Transport in gekweekte<em> Drosophila</em> Cellen: S2 cellijn en primaire neuronen.
Summary
Drosophila S2 cellen en gekweekte neuronen zijn zeer geschikt voor beeldvorming van motor aangedreven organel transport in vivo. Hier beschrijven we gedetailleerde protocollen voor het kweken van beide celtypen, hun beeldvorming en analyse van het vervoer.
Abstract
Drosophila S2 cellen op een dekglaasje in aanwezigheid van een actine-depolymeriseren geneesmiddelvorm lange onvertakte werkwijzen vol uniform gepolariseerd microtubuli. Organellen bewegen langs deze processen microtubule motoren. Gemakkelijk onderhoud, hoge gevoeligheid voor RNAi-gemedieerde proteïne knock-down en efficiënte procedure voor het maken van stabiele cellijnen Drosophila S2 cellen ideale modelsysteem vrachtvervoer bestuderen door levende beeldvorming. De met S2 cellen resultaten kunnen verder worden aangebracht op een fysiologisch relevante systeem: axonaal transport in primaire neuronen gekweekt uit gedissocieerde Drosophila embryo. Gekweekte neuronen groeien lange neurites gevuld met gebundelde microtubuli, zeer vergelijkbaar met S2 processen. Zoals in S2-cellen, organellen in gekweekte neuronen kan worden gevisualiseerd door een organel-specifieke fluorescente kleurstoffen of met fluorescente merkers organel gecodeerd door DNA geïnjecteerd in vroege embryo's of uitgedrukt in transgeneic vliegt. Daarom kan organel transport eenvoudig worden opgenomen in neuronen gekweekt op dekglaasjes met levende beeldvorming. Hier beschrijven we de procedures voor het kweken en visualiseren van het vrachtvervoer in Drosophila S2 cellen en primaire neuronen. Wij geloven dat deze protocollen maken beide systemen toegankelijk voor laboratoria bestuderen vrachtvervoer.
Introduction
Drosophila S2 cellen hebben opgedaan toenemende populariteit voor het bestuderen van vele cellulaire processen. Deze cellen werden oorspronkelijk verkregen van getrypsineerd laat stadium embryo's van OregonR Drosophila melanogaster en onderhouden van macrofaag-achtige functies 1. Drosophila S2 cellen bieden vele voordelen ten opzichte van andere cellijnen. Ze worden gekweekt bij 25 ° C zonder CO2 en kunnen worden afgebeeld vele uren bij kamertemperatuur zonder verwarming of gasuitwisseling. Belangrijker Drosophila S2 cellen zijn zeer gevoelig voor RNAi behandeling waardoor hoge rendement knockdown van eiwitten van belang. S2-cellen zijn zeer transfecteerbare en stabiele cellijnen kunnen worden geselecteerd in minder dan vier weken stabiele ectopische expressie van eiwitten van belang mogelijk. S2 cellen normaal te laten groeien ofwel losjes verbonden, maar niet verspreid op een fles of in suspensie. Ze kunnen worden geïnduceerd te verspreiden op dekglaasjes van tevoren met een plant lectine Concanavalin A (ConA). De omtrek van de verspreiding cellen is bijzonder dun en daarom ideaal voor levende cel microscopie. Gedetailleerde protocollen voor S2 cellen cultuur, RNAi behandeling, levende licht beeldvorming en immunostaining kan worden gevonden in de literatuur 2,3. Ons laboratorium heeft S2 cellen aangenomen als een modelsysteem voor de microtubuli-gebaseerde vrachtvervoer bestuderen. Drosophila S2 cellen behandeld met een geneesmiddel dat depolymeriseert of verbreekt F-actine, zoals cytochalasine D (CytoD), groeien lange processen gevuld met uniform gepolariseerde microtubuli 4 -10, waardoor het een ideaal systeem om lading beweging bestudeerd langs microtubuli arrays maakt. Verschillende parameters van transport in deze processen (. Dwz trajecten lengte, snelheden, richtinggevoeligheid enz.) kan gemakkelijk worden gemeten met behulp van geautomatiseerde deeltje tracking software, DiaTrack (Semasopht: http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423; Dr . Pascal Vallotton: http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-Informatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx # a4). Deze eigenschappen maken S2 cellen een aantrekkelijk systeem voor het bestuderen van vrachtvervoer langs microtubuli in weefselkweek cellen.
Proefprojecten in S2 cellen kunnen worden uitgebreid tot een fysiologisch belangrijk model van studies vrachtvervoer in Drosophila primaire neuronen. Net als S2-cellen, neuronen gekweekt uit gedissocieerde embryo's permeabel voor kleine moleculen zoals kleurstoffen en inhibitoren en hoge-resolutie beeldvorming van levende organel transport kan worden uitgevoerd in neuronen bij kamertemperatuur. Met behulp van Drosophila met verschillende genetische achtergronden, kunnen we gen-functie onderzoeken in primaire neuronen door knock-out (genetische verlies-van-functie mutaties), knock-down (dsRNA injectie of expressie) of ectopische expressie (transgene vliegen). Concreet betekent versnippering van actine filamenten gebruik CytoD behandeling belet niet dat neurietuitgroei, in plaats daarvan sneller groeien ze, en dus kunnen we bestuderen microtubuli-dependent organel transport in CytoD behandelde neuronen zonder de invloed van actine filamenten 11. Daarom primaire neuronale culturen combineren de voordelen van weefselkweek cellen en vliegen genetica, waardoor het een geweldig systeem om vrachtvervoer studeren in een fysiologisch relevante systeem 10,12 maakt. Sinds enkele familiale neurodegeneratieve ziekten kunnen worden veroorzaakt door of in verband met gebreken vracht vervoer (bijvoorbeeld de ziekte van Parkinson 13, de ziekte van Huntington 14, Ziekte van Alzheimer 15,16, amyotrofische laterale sclerose / ALS 17 HMN7B en Perry syndroom 18,19 en Spinocerebellaire soort ataxie 5/SCA5 20), kan de primaire neuronale culturen bruikbaar in de analyse van de effecten van specifieke mutaties veroorzaken deze ziekten voor de microtubuli-afhankelijke vervoer.
Tenslotte worden belangrijke eigenschappen van microtubuli-afhankelijk transport goed geconserveerd tussen zoogdieren en vliegen, maar <em> Drosophila genetische en celkweek minder duur en tijdrovend, die het gebruik van gekweekte Drosophila-cellen te bestuderen essentiële aspecten van organel transport in normale en pathologische omstandigheden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier presenteren we gedetailleerde protocollen voor het bestuderen van microtubuli-afhankelijke goederenvervoer in Drosophila S2 cellen en primaire neuron cultuur. Zowel S2 processen en neurites zijn structuren opgevuld door gebundelde microtubuli arrays die dienen als tracks voor organel transport.
Twee strategieën worden gewoonlijk gebruikt om label organellen: transfectie van vectoren die coderen voor een fluorescerend eiwit met een organel doelsequentie of kleuring met fluoresc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de leden van de Gelfand lab die de ontwikkeling van deze protocollen bijgedragen. Onderzoek gemeld in deze publicatie werd gesteund door het Nationale Instituut van Algemene Medische Wetenschappen van de National Institutes of Health onder nummer award R01GM052111 aan VIG en door Baskische regering Ministerie van Onderwijs, Universiteiten en Onderzoek onder nummer award BFI-2011-295 tot UDC.
Materials
| Powder Insect cell medium (Schneider’s) | Sigma | S9895 |
| Insect –Xpress medium | Fisher | BW12730Q |
| Insulin | Sigma | I6634 |
| Penicillin | Research Products International | P93000 |
| Streptomycin | Research Products International | S62000 |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T7660-5G |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 |
| Concanavalin A | Sigma | C2010 |
| Cytochalasin D | VWR | IC15077105 |
| LysoTracker Red DND-99 | Molecular Probes | L7528 |
| 100 µm Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 |
| 25 mm Circle cover glass | VWR | 48380 080 |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-730 |
| Disposable pellet pestles with matching microtubes | Kimble Chase | 749520-0000 |
References
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 27, 353-365 (1972).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence. 3, 606-611 (2008).
- Buster, D. W., Nye, J., Klebba, J. E., Rogers, G. C. Preparation of Drosophila S2 cells for light microscopy. J. Vis. Exp. (40), e1982 (2010).
- Ling, S. C., Fahrner, P. S., Greenough, W. T., Gelfand, V. I. Transport of Drosophila fragile X mental retardation protein-containing ribonucleoprotein granules by kinesin-1 and cytoplasmic dynein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17428-17433 (2004).
- Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
- Kim, H., et al. Microtubule binding by dynactin is required for microtubule organization but not cargo transport. J. Cell. Biol. 176, 641-651 (2007).
- Ally, S., Larson, A. G., Barlan, K., Rice, S. E., Gelfand, V. I. Opposite-polarity motors activate one another to trigger cargo transport in live cells. J. Cell. Biol. 187, 1071-1082 (2009).
- Bensenor, L. B., Barlan, K., Rice, S. E., Fehon, R. G., Gelfand, V. I. Microtubule-mediated transport of the tumor-suppressor protein Merlin and its mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 7311-7316 (2010).
- Jolly, A. L., et al. Kinesin-1 heavy chain mediates microtubule sliding to drive changes in cell shape. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 12151-12156 (2010).
- Barlan, K., Lu, W., Gelfand, V. I. The microtubule-binding protein ensconsin is an essential cofactor of Kinesin-1. Curr. Biol. 23, 317-322 (2013).
- Lu, W., Fox, P., Lakonishok, M., Davidson, M. W., Gelfand, V. I. Initial Neurite Outgrowth in Drosophila Neurons Is Driven by Kinesin-Powered Microtubule Sliding. Curr. Biol. 23, 1018-1023 (2013).
- Pathak, D., Sepp, K. J., Hollenbeck, P. J. Evidence that myosin activity opposes microtubule-based axonal transport of mitochondria. J. Neurosci. 30, 8984-8992 (2010).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441, 1162-1166 (2006).
- Gunawardena, S., et al. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
- Koo, E. H., et al. Precursor of amyloid protein in Alzheimer disease undergoes fast anterograde axonal transport. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1561-1565 (1990).
- Stokin, G. B., Goldstein, L. S. Axonal transport and Alzheimer’s disease. Annu. Rev. Biochem. 75, 607-627 (2006).
- Bilsland, L. G., et al. Deficits in axonal transport precede ALS symptoms in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20523-20528 (2010).
- Lloyd, T. E., et al. The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini. Neuron. 74, 344-360 (2012).
- Moughamian, A. J., Holzbaur, E. L. Dynactin is required for transport initiation from the distal axon. Neuron. 74, 331-343 (2012).
- Lorenzo, D. N., et al. Spectrin mutations that cause spinocerebellar ataxia type 5 impair axonal transport and induce neurodegeneration in Drosophila. J. Cell. Biol. 189, 143-158 (2010).
- Robinow, S., White, K. The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages. Dev. Biol. 126, 294-303 (1988).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Furst, A., Mahowald, A. P. Differentiation of primary embryonic neuroblasts in purified neural cell cultures from Drosophila. Dev. Biol. 109, 184-192 (1985).
- Salvaterra, P. M., Bournias-Vardiabasis, N., Nair, T., Hou, G., Lieu, C. In vitro neuronal differentiation of Drosophila embryo cells. J. Neurosci. 7, 10-22 (1987).
- Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. J. Cell. Biol. 136, 71-80 (1997).
- Rizzuto, R., et al. A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues. J. Biol. Chem. 264, 10595-10600 (1989).
- Poot, M., et al. Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains. J. Histochem. Cytochem. 44, 1363-1372 (1996).
- Haller, T., Dietl, P., Deetjen, P., Volkl, H. The lysosomal compartment as intracellular calcium store in MDCK cells: a possible involvement in InsP3-mediated Ca2+ release. Cell Calcium. 19, 157-165 (1996).
