Orgánulos Transporte en Cultivadas<em> Drosophila</em> Celdas: S2 Línea Celular y neuronas primarias.
Summary
Células S2 de Drosophila y neuronas cultivadas son grandes sistemas de obtención de imágenes de orgánulos de transporte con motor in vivo. Aquí se describen los protocolos detallados para el cultivo de ambos tipos de células, su imagen y el análisis de los transportes.
Abstract
Células S2 de Drosophila sembraron en un cubreobjetos en la presencia de cualquier largos procesos no ramificados forma de fármaco actina-despolimerización de microtúbulos llenas de manera uniforme polarizadas. Orgánulos se mueven a lo largo de estos procesos a través de los motores de microtúbulos. Fácil mantenimiento, alta sensibilidad a la proteína mediada por RNAi knock-down y un procedimiento eficaz para la creación de líneas celulares estables que hacen las células S2 de Drosophila un sistema modelo ideal para estudiar el transporte de carga por la imagen en vivo. Los resultados obtenidos con las células S2 se pueden aplicar además a un fisiológicamente más relevantes del sistema: el transporte axonal en las neuronas primarias cultivadas a partir de embriones de Drosophila disociadas. Neuronas cultivadas crecen neuritas largas llenas de microtúbulos agrupados, muy similares a los procesos de S2. Al igual que en las células S2, orgánulos en neuronas cultivadas pueden ser visualizados por cualquiera de los tintes fluorescentes-orgánulo específico o mediante el uso de marcadores de orgánulos fluorescentes codificadas por ADN inyectado en embriones tempranos o expresado en transgenic vuela. Por lo tanto, el transporte de orgánulos se puede grabar fácilmente en neuronas cultivadas en cubreobjetos de vidrio utilizando imágenes viviente. Aquí se describen los procedimientos para el cultivo y la visualización de transporte de carga en las células S2 de Drosophila y neuronas primarias. Creemos que estos protocolos hacen ambos sistemas accesibles para los laboratorios que estudian el transporte de carga.
Introduction
Células S2 de Drosophila han ganado cada vez más popularidad para el estudio de muchos procesos celulares. Estas células se obtuvieron originalmente de tripsinizadas embriones en fase tardía de OregonR Drosophila melanogaster y mantienen características similares a los macrófagos 1. Células S2 de Drosophila ofrecen muchas ventajas sobre otras líneas celulares. Ellos se cultivan a 25 ° C sin CO 2, y se pueden obtener imágenes para muchas horas a temperatura ambiente sin la necesidad de calefacción o el intercambio de gases. Más importante aún, las células S2 de Drosophila son muy sensibles al tratamiento de RNAi desmontables permitiendo alta eficiencia de proteínas de interés. Células S2 son altamente transfectables y líneas celulares estables se pueden seleccionar en menos de cuatro semanas para permitir la expresión ectópica estable de proteínas de interés. S2 células crecen normalmente bien vagamente unidos pero no se diseminan en un frasco o en suspensión. Ellos pueden ser inducidas a propagarse en cubreobjetos recubiertos previamente con un Conca lectina plantaNavalin A (ConA). La periferia de las células propagadas es especialmente fina y por lo tanto es ideal para microscopia de células vivas. Protocolos detallados para el cultivo las células S2, el tratamiento de RNAi, las imágenes en directo y de inmunotinción se pueden encontrar en la literatura 2,3. Nuestro laboratorio ha adoptado células S2 como un sistema modelo para estudiar el transporte de carga a base de microtúbulos. Células S2 de Drosophila tratados con cualquier fármaco que despolimeriza o corta la F-actina, tales como citocalasina D (CytoD), crecen los procesos largos llenos de microtúbulos uniformemente polarizadas 4 -10, lo que lo convierte en un sistema ideal para estudiar el movimiento de carga a lo largo de los microtúbulos arrays. Diferentes parámetros de transporte en estos procesos (es decir. Trayectorias longitudes, velocidades, direccionalidad, etc) se pueden medir fácilmente utilizando el software de partículas de seguimiento automatizado, DiaTrack (Semasopht: http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423; Dr. . Pascal Vallotton: http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-Informatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx # A4). Estas propiedades hacen que las células S2 un sistema atractivo para el estudio de transporte de carga a lo largo de los microtúbulos en células de cultivo de tejidos.
Los experimentos piloto en células S2 se pueden extender a un modelo fisiológicamente importante de los estudios de transporte de carga en las neuronas primarias de Drosophila. De manera similar a las células S2, neuronas cultivadas a partir de embriones disociadas son permeables a las moléculas pequeñas tales como colorantes y los inhibidores de, y de alta resolución de imágenes en vivo de orgánulos de transporte se pueden realizar en las neuronas a temperatura ambiente. Usando Drosophila con diferentes antecedentes genéticos, podemos examinar la función de genes en las neuronas primarias por nocaut (mutaciones genéticas de pérdida de la función), caída (inyección de dsRNA o expresión) o la expresión ectópica (moscas transgénicas). En concreto, la fragmentación de los filamentos de actina utilizando tratamiento CytoD no impide el crecimiento de neuritas, sino que crecen más rápido, y por lo tanto podemos estudiar microtúbulos Dependeorgánulos de transporte NT en las neuronas tratadas con CytoD sin la influencia de los filamentos de actina 11. Por lo tanto, los cultivos primarios de neuronas combinan las ventajas de las células de cultivo de tejidos y vuelan genética, lo que hace que sea un gran sistema para estudiar el transporte de carga en un sistema fisiológico relevante 10,12. Dado que algunas enfermedades neurodegenerativas familiares podrían ser causados por o asociados con defectos de transporte de carga (por ejemplo, la enfermedad de Parkinson 13, la enfermedad de Huntington 14, la enfermedad de Alzheimer 15,16, la esclerosis lateral amiotrófica / ALS 17, síndrome HMN7B y Perry 18,19 y el tipo de ataxia espinocerebelosa 5/SCA5 20), cultivos primarios de neuronas pueden ser útiles en el análisis de los efectos de las mutaciones específicas que causan estas enfermedades en el transporte dependiente de microtúbulos.
Por último, las propiedades importantes de transporte dependiente de microtúbulos están bien conservadas entre los mamíferos y las moscas, pero <em> Cultura genética y de células de Drosophila es menos costoso y consume mucho tiempo, lo que justifica el uso de células de Drosophila cultivadas para estudiar los aspectos esenciales de orgánulos de transporte en condiciones normales y patológicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí presentamos los protocolos detallados para estudiar el transporte de carga dependiente de microtúbulos en las células S2 de Drosophila y la cultura de la neurona primaria. Ambos procesos y neuritas S2 son estructuras llenas de paquetes de microtúbulos arrays que sirven como pistas para el transporte de orgánulos.
Dos estrategias se utilizan típicamente a orgánulos de la etiqueta: la transfección de vectores que codifican una proteína fluorescente con una secuencia de o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los miembros del laboratorio de Gelfand que contribuyeron al desarrollo de estos protocolos. Las investigaciones realizadas en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de la Salud bajo el número de concesión R01GM052111 a VIG y por el Departamento del Gobierno Vasco de Educación, Universidades e Investigación con el número premio BFI-2011-295 a UdC.
Materials
| Powder Insect cell medium (Schneider’s) | Sigma | S9895 |
| Insect –Xpress medium | Fisher | BW12730Q |
| Insulin | Sigma | I6634 |
| Penicillin | Research Products International | P93000 |
| Streptomycin | Research Products International | S62000 |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T7660-5G |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 |
| Concanavalin A | Sigma | C2010 |
| Cytochalasin D | VWR | IC15077105 |
| LysoTracker Red DND-99 | Molecular Probes | L7528 |
| 100 µm Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 |
| 25 mm Circle cover glass | VWR | 48380 080 |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-730 |
| Disposable pellet pestles with matching microtubes | Kimble Chase | 749520-0000 |
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