Органелл Транспорт в культуре<em> Дрозофилы</em> Клетки: S2 клеточной линии и первичных нейронов.
Summary
Drosophila S2 клетки и культивируемые нейроны большие системы для визуализации с приводом от двигателя органелл транспорта в естественных условиях. Здесь мы опишем подробные протоколы для культивирования клеток обоих видов, их визуализации и анализа транспорта.
Abstract
Drosophila S2 клетки высевали на покровное в присутствии любых актин-деполимеризации лекарственной формы длинных неразветвленных процессов, заполненных равномерно поляризованных микротрубочек. Органеллы двигаться вдоль этих процессов микротрубочек двигателей. Простота обслуживания, высокая чувствительность к РНК-интерференции-опосредованной белка нокдаун и эффективной процедуры для создания стабильных клеточных линий сделать дрозофилы S2 клетках идеальную модель системы для изучения Грузовой живого изображения. Результаты, полученные с S2 клетках может быть дополнительно применен к более физиологически соответствующие системы: аксонального транспорта в первичных нейронах, культивированных из диссоциированных эмбрионов Drosophila. Искусственный нейроны растут длинные нейриты наполненные комплекте микротрубочек, очень похожих на S2 процессов. Как и в S2 клетках, органеллы в культуре нейронов могут быть визуализированы либо органеллоспецифичными флуоресцентных красителей или с помощью флуоресцентных маркеров органелл, кодируемые ДНК вводят в ранних эмбрионов или выражается в трансгеннойМикросхема летит. Поэтому органелл транспорт может быть легко записаны в нейронах, культивируемых на покровные стекла с использованием живого изображения. Здесь мы опишем процедуры культивирования и визуализации грузовых перевозок в дрозофилы S2 клетках и первичных нейронов. Мы считаем, что эти протоколы сделать обе системы доступны для лабораторий, изучающих грузовых перевозок.
Introduction
Drosophila S2 клетки приобрели большую популярность для изучения многих клеточных процессов. Эти клетки были первоначально получены из трипсинизировали конце эмбрионов стадии OregonR дрозофилы и поддерживать макрофагов-подобные функции 1. Дрозофилы S2 клетки имеют много преимуществ по сравнению с другими клеточными линиями. Они культивировали при 25 ° С без CO 2, и может быть отображены в течение многих часов при комнатной температуре без необходимости нагрева или газообмена. Что еще более важно, Drosophila S2 клетки очень чувствительны к лечению RNAi, позволяя высокой эффективности нокдаун интерес белков. S2 клетки очень transfectable и стабильные клеточные линии могут быть выбраны менее чем за четыре недели, чтобы позволить стабильную эктопическую экспрессию белков, представляющих интерес. S2 клетки обычно растут либо косвенное отношение, но не распространяются на колбе или в суспензии. Они могут быть вызваны для распространения на покровных предварительно покрытых с завода лектинов Конкаnavalin (КонА). Периферии распространенных клеток особенно тонкими и поэтому идеально подходит для живых клеток микроскопии. Подробные протоколы для S2 культуре клеток, лечения РНК-интерференции, живого изображения света и иммуноокрашивания можно найти в литературе 2,3. Наша лаборатория приняла S2 клетки в качестве модельной системы для изучения микротрубочек на основе грузовых перевозок. Дрозофилы S2 клетки, обработанные любой препарат, который depolymerizes или разрывает F-актин, например, цитохалазина D (CytoD), отращивать длинные процессы, заполненные равномерно поляризованных микротрубочек 4 -10, что делает его идеальной системой для изучения перемещения грузов по микротрубочек. Различные параметры транспорта в этих процессах (. Т.е. длины траектории, скорости, направленности и т.д.) может быть легко измерено с помощью автоматизированного программного обеспечения частиц отслеживания, DiaTrack (Semasopht: http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423, д-р . Паскаль Валлотон: http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-Informatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx # а4). Эти свойства делают S2 клетках привлекательный систему для изучения грузового транспорта вдоль микротрубочек в клетках тканевой культуры.
Пилотные эксперименты в S2 клетках может быть продлен до физиологически важных модели грузовых транспортных исследований в дрозофилы первичных нейронов. Как и в S2 клетках, нейроны культивировали от диссоциированных эмбрионов проницаемы для малых молекул, таких как красители и ингибиторы, и с высоким разрешением живой визуализации органелл транспорта может быть выполнена в нейронах при комнатной температуре. Использование дрозофилы с различными генетическим фоном, мы можем исследовать функции генов в первичных нейронов нокаутом (генетические с потерей функции мутации), нокдаун (дсРНК инъекции или выражение) или эктопическая экспрессия (трансгенные мухи). В частности, фрагментация нитей актина с использованием лечение CytoD не мешает рост аксонов, вместо этого они растут быстрее, и, таким образом мы можем изучать микротрубочек-зависимнт органелл транспорт в CytoD обработанных нейронов без влияния нитей актина 11. Таким образом, первичные нейронные культуры объединить преимущества тканевых культур клеток и летать генетику, что делает его отличным системой для изучения грузовых перевозок в физиологическом соответствующей системы 10,12. Поскольку несколько семейные нейродегенеративные заболевания могут быть вызваны или связаны с грузовых транспортных дефектов (например, болезнь Паркинсона 13, болезнь Хантингтона 14, болезнь Альцгеймера 15,16, боковой амиотрофический склероз / ALS 17, HMN7B и Перри синдром 18,19, и спиноцеребеллярной Тип атаксия 5/SCA5 20), первичных нейронов культур может быть полезным при анализе эффектов специфических мутаций, вызывающих эти заболевания на микротрубочек в зависимости от транспорта.
Наконец, важные свойства микротрубочек в зависимости от транспорта хорошо сохраняется между млекопитающих и мух, но <em> Дрозофилы генетической и клеточной культуры является менее дорогостоящим и трудоемким, оправдывая использование культивируемых клетках дрозофилы для изучения основные аспекты органелл транспорта в норме и при патологии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы представляем подробные протоколы для изучения микротрубочек в зависимости от грузовых перевозок в дрозофилы S2 клетках и первичной культуре нейронов. Оба процесса S2 и невриты являются структуры, заполненные комплекте микротрубочек массивов, которые служат треков для ор?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим членов лаборатории Гельфанда которые внесли вклад в развитие этих протоколов. Исследования сообщили в настоящей публикации при поддержке Национального института Генеральной медицинских наук из Национального института здоровья в рамках премии числа R01GM052111 к VIG и Постановлением Правительства департамента Басков образования, университетов и исследований при награда числа BFI-2011-295, чтобы УДК.
Materials
| Powder Insect cell medium (Schneider’s) | Sigma | S9895 |
| Insect –Xpress medium | Fisher | BW12730Q |
| Insulin | Sigma | I6634 |
| Penicillin | Research Products International | P93000 |
| Streptomycin | Research Products International | S62000 |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T7660-5G |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 |
| Concanavalin A | Sigma | C2010 |
| Cytochalasin D | VWR | IC15077105 |
| LysoTracker Red DND-99 | Molecular Probes | L7528 |
| 100 µm Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 |
| 25 mm Circle cover glass | VWR | 48380 080 |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-730 |
| Disposable pellet pestles with matching microtubes | Kimble Chase | 749520-0000 |
References
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 27, 353-365 (1972).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence. 3, 606-611 (2008).
- Buster, D. W., Nye, J., Klebba, J. E., Rogers, G. C. Preparation of Drosophila S2 cells for light microscopy. J. Vis. Exp. (40), e1982 (2010).
- Ling, S. C., Fahrner, P. S., Greenough, W. T., Gelfand, V. I. Transport of Drosophila fragile X mental retardation protein-containing ribonucleoprotein granules by kinesin-1 and cytoplasmic dynein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17428-17433 (2004).
- Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
- Kim, H., et al. Microtubule binding by dynactin is required for microtubule organization but not cargo transport. J. Cell. Biol. 176, 641-651 (2007).
- Ally, S., Larson, A. G., Barlan, K., Rice, S. E., Gelfand, V. I. Opposite-polarity motors activate one another to trigger cargo transport in live cells. J. Cell. Biol. 187, 1071-1082 (2009).
- Bensenor, L. B., Barlan, K., Rice, S. E., Fehon, R. G., Gelfand, V. I. Microtubule-mediated transport of the tumor-suppressor protein Merlin and its mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 7311-7316 (2010).
- Jolly, A. L., et al. Kinesin-1 heavy chain mediates microtubule sliding to drive changes in cell shape. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 12151-12156 (2010).
- Barlan, K., Lu, W., Gelfand, V. I. The microtubule-binding protein ensconsin is an essential cofactor of Kinesin-1. Curr. Biol. 23, 317-322 (2013).
- Lu, W., Fox, P., Lakonishok, M., Davidson, M. W., Gelfand, V. I. Initial Neurite Outgrowth in Drosophila Neurons Is Driven by Kinesin-Powered Microtubule Sliding. Curr. Biol. 23, 1018-1023 (2013).
- Pathak, D., Sepp, K. J., Hollenbeck, P. J. Evidence that myosin activity opposes microtubule-based axonal transport of mitochondria. J. Neurosci. 30, 8984-8992 (2010).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441, 1162-1166 (2006).
- Gunawardena, S., et al. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
- Koo, E. H., et al. Precursor of amyloid protein in Alzheimer disease undergoes fast anterograde axonal transport. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1561-1565 (1990).
- Stokin, G. B., Goldstein, L. S. Axonal transport and Alzheimer’s disease. Annu. Rev. Biochem. 75, 607-627 (2006).
- Bilsland, L. G., et al. Deficits in axonal transport precede ALS symptoms in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20523-20528 (2010).
- Lloyd, T. E., et al. The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini. Neuron. 74, 344-360 (2012).
- Moughamian, A. J., Holzbaur, E. L. Dynactin is required for transport initiation from the distal axon. Neuron. 74, 331-343 (2012).
- Lorenzo, D. N., et al. Spectrin mutations that cause spinocerebellar ataxia type 5 impair axonal transport and induce neurodegeneration in Drosophila. J. Cell. Biol. 189, 143-158 (2010).
- Robinow, S., White, K. The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages. Dev. Biol. 126, 294-303 (1988).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Furst, A., Mahowald, A. P. Differentiation of primary embryonic neuroblasts in purified neural cell cultures from Drosophila. Dev. Biol. 109, 184-192 (1985).
- Salvaterra, P. M., Bournias-Vardiabasis, N., Nair, T., Hou, G., Lieu, C. In vitro neuronal differentiation of Drosophila embryo cells. J. Neurosci. 7, 10-22 (1987).
- Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. J. Cell. Biol. 136, 71-80 (1997).
- Rizzuto, R., et al. A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues. J. Biol. Chem. 264, 10595-10600 (1989).
- Poot, M., et al. Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains. J. Histochem. Cytochem. 44, 1363-1372 (1996).
- Haller, T., Dietl, P., Deetjen, P., Volkl, H. The lysosomal compartment as intracellular calcium store in MDCK cells: a possible involvement in InsP3-mediated Ca2+ release. Cell Calcium. 19, 157-165 (1996).
