Drosophila S2 celler og kultiverte nevroner er gode systemer for avbildning av motordrevet organelle transport in vivo. Her beskriver vi detaljerte protokoller for dyrking av begge celletyper, deres avbildning og analyse av transport.
Drosophila S2 celler belagt på et dekkglass i nærvær av noen aktin-depolymerisering narkotika danner lange unbranched prosesser fylt med jevnt polarisert mikrotubuli. Organeller bevege seg langs disse prosessene ved microtubule motorer. Enkelt vedlikehold, høy følsomhet for RNAi-mediert protein knock-down og effektiv prosedyre for å skape stabile cellelinjer gjør Drosophila S2 celler en ideell modell system for å studere transport av varer av levende avbildning. Resultatene oppnådd med S2 celler resultatene kan videre brukes på en mer fysiologisk relevant system: aksonal transport i primære nerveceller dyrket fra dissosiert Drosophila embryoer. Dyrkede nerveceller vokser lange neurites fylt med medfølgende mikrotubuli, svært lik S2 prosesser. Som i S2-celler, organeller kan i dyrkede neuroner visualiseres ved enten organellespesifikk fluorescerende fargestoffer eller ved hjelp av fluorescerende markører organelle kodet av DNA injiseres i tidlige embryoer eller uttrykt i transgenic flyr. Derfor kan organelle transport være lett registreres i nerveceller dyrket på glass dekkglass ved hjelp av levende bilder. Her beskriver vi prosedyrer for dyrking og visualisere transport av varer i Drosophila S2 elementer og nevroner. Vi tror at disse protokollene gjøre begge systemer tilgjengelig for laboratorier som studerer transport av varer.
Drosophila S2 celler har fått økende popularitet for å studere mange cellulære prosesser. Disse cellene ble opprinnelig hentet fra trypsinisert sent stadium embryoer fra OregonR Drosophila melanogaster og vedlikeholde makrofag-lignende funksjoner en. Drosophila S2 celler har mange fordeler fremfor andre cellelinjer. De er dyrket ved 25 ° C uten CO2 og kan avbildes i mange timer ved romtemperatur uten behov for varme-eller gassutveksling. Enda viktigere, Drosophila S2 celler er svært følsomme for RNAi behandling slik at høy effektivitet knockdown av proteiner av interesse. S2-celler er svært transfectable og stabile cellelinjer kan velges mindre enn fire uker for å tillate stabil ektopisk ekspresjon av proteiner av interesse. S2-celler som normalt vokser enten løst festet, men ikke spredt på en kolbe eller i suspensjon. De kan bli overtalt til å spre seg på dekkglass-belagt med en plante lectin concanavalin A (ConA). Periferien av de spredte celler er særlig tynn og derfor er ideell for levende celle mikroskopi. Detaljerte protokoller for S2 celler kultur, RNAi behandling, levende lys bildebehandling og farging kan bli funnet i litteraturen 2,3. Laboratoriet er innført S2-celler som et modellsystem for å studere microtubule baserte transport av varer. Drosophila S2-celler som ble behandlet med en hvilken som helst medikament som depolymerizes eller Severs F-aktin, så som cytokalasin D (CytoD), vokser lange prosesser fylt med jevnt polarisert mikrotubuli 4 -10, noe som gjør det til et ideelt system for å studere last bevegelse langs microtubule arrays. Ulike parametre for transport i disse prosessene (. Dvs. baner lengder, hastigheter, retnings etc) lett kan måles ved hjelp av automatisert partikkel-sporing, DiaTrack (Semasopht: http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423; Dr . Pascal Vallotton: http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-Informatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx # a4). Disse egenskapene gjør S2-celler til et attraktivt system for å studere transport av varer langs mikrotubuli i vevskultur-celler.
Pilot eksperimenter i S2-celler kan bli utvidet til et fysiologisk viktig modell av transport-last studier i Drosophila primære neuroner. I likhet med S2-celler, nerveceller dyrket fra dissosierte embryoer er gjennomtrengelig for små molekyler slik som fargestoffer og-inhibitorer, og høy oppløsning direkte avbildning av organelle transport kan utføres i nevroner ved romtemperatur. Ved hjelp av Drosophila med ulike genetiske bakgrunn, kan vi undersøke gen-funksjon i primær nevroner på knockout (genetiske tap-av-funksjon mutasjoner), knockdown (dsrna injeksjon eller uttrykk) eller ektopisk uttrykk (transgene fluer). Konkret betyr fragmentering av aktin filamenter som bruker CytoD behandling ikke hindre neurite utvekst, i stedet de vokser raskere, og dermed kan vi studere microtubuli-dependent organelle transport i CytoD-behandlede neuroner uten påvirkning av aktin filamenter 11.. Derfor primære nevrale kulturer kombinere fordelene med vevskulturceller og fly genetikk, noe som gjør det til et godt system for å studere transport av varer i en fysiologisk relevant system 10,12. Siden flere familiære nevrodegenerative sykdommer kan være forårsaket av eller assosiert med cargo transport defekter (f.eks Parkinsons sykdom 13, Huntingtons sykdom 14, Alzheimers Disease 15,16, Amyotrofisk lateral sklerose / ALS 17, HMN7B og Perry syndrom 18,19, og Spinocerebellar ataksi typen 5/SCA5 20), kan det primære nevronale kulturer være nyttig ved analyse av virkningene av spesifikke mutasjoner som forårsaker disse sykdommene på mikrotubulus-avhengige transport.
Til slutt, er viktige egenskaper for microtubule avhengig transport godt bevart mellom pattedyr og fluer, men <em> Drosophila genetisk og cellekultur er mindre kostbart og tidkrevende, rettferdiggjøre bruken av dyrkede Drosophila-celler for å studere vesentlige aspekter ved organelle transport under normale og patologiske forhold.
Her presenterer vi detaljerte protokoller for å studere mikrotubulus avhengig transport av varer i Drosophila S2 celler og primær nevron kultur. Både S2 prosesser og neurites er strukturer fylt av buntet mikrotubuli arrays som fungerer som spor for organelle transport.
To strategier er vanligvis brukes til å merke organ: transfeksjon av vektorer som koder for et fluorescerende protein med en organelle-targeting sekvens eller farging med fluorescerende fargestoffer lagt direkte t…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker medlemmene av Gelfand lab som har bidratt til utviklingen av disse protokollene. Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Institute of General Medical Science of National Institutes of Health i henhold award nummer R01GM052111 til VIG og ved baskiske regjeringen Department of Education, universiteter og forskningsdepartementet i henhold award nummer BFI-2011-295 til UDC.
Powder Insect cell medium (Schneider’s) | Sigma | S9895 |
Insect –Xpress medium | Fisher | BW12730Q |
Insulin | Sigma | I6634 |
Penicillin | Research Products International | P93000 |
Streptomycin | Research Products International | S62000 |
Tetracycline hydrochloride | Sigma | T7660-5G |
Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 |
Concanavalin A | Sigma | C2010 |
Cytochalasin D | VWR | IC15077105 |
LysoTracker Red DND-99 | Molecular Probes | L7528 |
100 µm Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 |
25 mm Circle cover glass | VWR | 48380 080 |
Drosophila Vials | VWR | 89092-730 |
Disposable pellet pestles with matching microtubes | Kimble Chase | 749520-0000 |