Organell Transport i Odlade<em> Drosophila</em> Celler: S2 cellinje och primär nervceller.
Summary
Drosophila S2-celler och odlade neuroner är stora system för avbildning av motordriven organelltransport in vivo. Här beskriver vi detaljerade protokoll för odling av båda celltyperna, deras avbildning och analys av transport.
Abstract
Drosophila S2 celler ut på ett täckglas i närvaro av eventuella aktin-depolymerizing drog bildar långa ogrenade processer fyllda med enhetligt polarise mikrotubuli. Organeller förflytta sig längs dessa processer genom mikrotubuli motorer. Enkelt underhåll, hög känslighet för RNAi-medierad protein knock-down och effektivt förfarande för att skapa stabila cellinjer gör Drosophila S2 celler ett perfekt modellsystem för att studera lasttransport av levande avbildning. De resultat som erhölls med S2-celler kan appliceras vidare till ett mer fysiologiskt relevant System: axonal transport i primära neuroner odlade från dissocierade Drosophila embryon. Odlade nervceller växer långa neuriter fyllda med medföljande mikrotubuli, mycket liknar S2 processer. Liksom i S2-celler, kan organeller i odlade nervceller visualiseras genom antingen organell-specifik fluorescerande färger eller med hjälp av fluorescerande organell markörer som kodas av DNA injiceras i tidiga embryon eller uttryckt i transgenic flugor. Därför kan organell transport lätt in i nervceller odlade på täckglas med hjälp av levande avbildning. Här beskriver vi rutiner för odling och visualisera godstransporter i Drosophila S2-celler och primära neuroner. Vi tror att dessa protokoll gör båda systemen tillgängliga för labb studerar godstransporter.
Introduction
Drosophila S2 celler har vunnit allt större popularitet för att studera många cellulära processer. Dessa celler ursprungligen erhölls från trypsinerade sent stadium embryon av OregonR Drosophila melanogaster och upprätthålla makrofager-liknande funktioner 1. Drosophila S2 celler har många fördelar jämfört med andra cellinjer. De odlades vid 25 ° C utan CO2 och kan avbildas under flera timmar vid rumstemperatur utan behov av värme-eller gasutbyte. Ännu viktigare, Drosophila S2-celler är mycket känsliga för RNAi behandling tillåter högeffektiv knockdown av proteiner av intresse. S2-celler är mycket transfekterbara och stabila cellinjer kan väljas på mindre än fyra veckor för att möjliggöra stabil ektopisk uttryck av proteiner av intresse. S2-celler växer normalt antingen löst kopplade men inte spridas på en flaska eller i suspension. De kan induceras att spridas på täckglas förbelagda med en växt-lektin concanavalin A (ConA). Periferin av spridda celler är särskilt tunn och därför är idealisk för levande cell mikroskopi. Detaljerade protokoll för S2 celler kultur, RNAi behandling, levande ljus bildbehandling och immunfärgning kan hittas i litteraturen 2,3. Vårt labb har antagit S2 celler som modellsystem för att studera mikrotubuli-baserade lasttransport. Drosophila S2-celler som behandlats med något läkemedel som depolymeriserar eller bryter F-aktin, såsom cytochalasin D (CytoD), växer långa processer fyllda med enhetligt polarise mikrotubuli 4 -10, vilket gör det till ett idealiskt system för att studera last rörelse längs mikrotubuli matriser. Olika parametrar för transport i dessa processer (. Dvs banor längder, hastigheter rikt etc) kan lätt mätas med hjälp av automatisk partikel-mjukvara, DiaTrack (Semasopht: http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423; Dr . Pascal Vallottons: http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-Informatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx # a4). Dessa egenskaper gör S2 celler en tilltalande system för att studera lasttransport längs mikrotubuli i vävnadsodlingsceller.
Pilotverksamhet S2 celler kan utökas till ett fysiologiskt viktig modell för studier godstransport i Drosophila primära nervceller. Liknar S2 celler, neuroner odlade från dissocierade embryon är genomsläppliga för små molekyler såsom färgämnen och hämmare, och högupplösta live-avbildning av organell transporter kan utföras på nervceller i rumstemperatur. Använda Drosophila med olika genetisk bakgrund, kan vi undersöka geners funktion i primära neuroner genom knockout (genetisk förlust-av-funktion mutationer), knockdown (dsRNA injektion eller uttryck) eller ektopisk uttryck (transgena flugor). Specifikt innebär fragmentering av aktin filament med hjälp CytoD behandling inte hindra neuritutväxt, utan de växer snabbare, och på så sätt kan vi studera mikrotubuli-dependent organell transporter i CytoD-behandlade neuroner utan påverkan av aktin filament 11. Därför primära neuronala kulturer kombinera fördelarna med vävnadsodlingsceller och flyga genetik, vilket gör det till ett bra system för att studera lasttransport i ett fysiologiskt relevant systemet 10,12. Eftersom flera familjära neurodegenerativa sjukdomar kan orsakas av eller i samband med defekter godstransport (t.ex. Parkinsons sjukdom 13, Huntingtons sjukdom 14, Alzheimers sjukdom 15,16, amyotrofisk lateralskleros / ALS 17 HMN7B och Perry syndrom 18,19, och Spinocerebellär ataxi typ 5/SCA5 20), kan primära neuronala kulturer vara användbar i analysen av effekterna av specifika mutationer som orsakar dessa sjukdomar på mikrotubuli beroende transportsektorn.
Slutligen är viktiga egenskaper hos mikrotubuli beroende transporter väl bevarad mellan däggdjur och flugor, men <em> Drosophila genetiska och cellkultur är mindre dyr och tidskrävande, motiverar valet av odlade Drosophila celler för att studera viktiga aspekter av organell transport i normala och patologiska tillstånd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här presenterar vi detaljerade protokoll för att studera mikrotubuli beroende godstransporter i Drosophila S2-celler och primära neuron kultur. Både S2 processer och neuriter är strukturer fyllda av buntade mikrotubuli matriser som fungerar som spår för organell transporter.
Två strategier användes typiskt för att märka organeller: transfektion av vektorer som kodar för ett fluorescerande protein med en organell-målsökningssekvensen eller färgning med fluorescerande f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar ledamöterna i Gelfand labbet som bidragit till utvecklingen av dessa protokoll. Forskningen redovisas i denna publikation stöddes av National Institute of General Medical Science of the National Institutes of Health i utmärkelsen nummer R01GM052111 till VIG och baskiska regeringen Institutionen för utbildning, universitet och forskning inom utmärkelsen nummer BFI-2011-295 till UDC.
Materials
| Powder Insect cell medium (Schneider’s) | Sigma | S9895 |
| Insect –Xpress medium | Fisher | BW12730Q |
| Insulin | Sigma | I6634 |
| Penicillin | Research Products International | P93000 |
| Streptomycin | Research Products International | S62000 |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T7660-5G |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 |
| Concanavalin A | Sigma | C2010 |
| Cytochalasin D | VWR | IC15077105 |
| LysoTracker Red DND-99 | Molecular Probes | L7528 |
| 100 µm Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 |
| 25 mm Circle cover glass | VWR | 48380 080 |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-730 |
| Disposable pellet pestles with matching microtubes | Kimble Chase | 749520-0000 |
References
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 27, 353-365 (1972).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence. 3, 606-611 (2008).
- Buster, D. W., Nye, J., Klebba, J. E., Rogers, G. C. Preparation of Drosophila S2 cells for light microscopy. J. Vis. Exp. (40), e1982 (2010).
- Ling, S. C., Fahrner, P. S., Greenough, W. T., Gelfand, V. I. Transport of Drosophila fragile X mental retardation protein-containing ribonucleoprotein granules by kinesin-1 and cytoplasmic dynein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17428-17433 (2004).
- Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
- Kim, H., et al. Microtubule binding by dynactin is required for microtubule organization but not cargo transport. J. Cell. Biol. 176, 641-651 (2007).
- Ally, S., Larson, A. G., Barlan, K., Rice, S. E., Gelfand, V. I. Opposite-polarity motors activate one another to trigger cargo transport in live cells. J. Cell. Biol. 187, 1071-1082 (2009).
- Bensenor, L. B., Barlan, K., Rice, S. E., Fehon, R. G., Gelfand, V. I. Microtubule-mediated transport of the tumor-suppressor protein Merlin and its mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 7311-7316 (2010).
- Jolly, A. L., et al. Kinesin-1 heavy chain mediates microtubule sliding to drive changes in cell shape. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 12151-12156 (2010).
- Barlan, K., Lu, W., Gelfand, V. I. The microtubule-binding protein ensconsin is an essential cofactor of Kinesin-1. Curr. Biol. 23, 317-322 (2013).
- Lu, W., Fox, P., Lakonishok, M., Davidson, M. W., Gelfand, V. I. Initial Neurite Outgrowth in Drosophila Neurons Is Driven by Kinesin-Powered Microtubule Sliding. Curr. Biol. 23, 1018-1023 (2013).
- Pathak, D., Sepp, K. J., Hollenbeck, P. J. Evidence that myosin activity opposes microtubule-based axonal transport of mitochondria. J. Neurosci. 30, 8984-8992 (2010).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441, 1162-1166 (2006).
- Gunawardena, S., et al. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
- Koo, E. H., et al. Precursor of amyloid protein in Alzheimer disease undergoes fast anterograde axonal transport. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1561-1565 (1990).
- Stokin, G. B., Goldstein, L. S. Axonal transport and Alzheimer’s disease. Annu. Rev. Biochem. 75, 607-627 (2006).
- Bilsland, L. G., et al. Deficits in axonal transport precede ALS symptoms in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20523-20528 (2010).
- Lloyd, T. E., et al. The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini. Neuron. 74, 344-360 (2012).
- Moughamian, A. J., Holzbaur, E. L. Dynactin is required for transport initiation from the distal axon. Neuron. 74, 331-343 (2012).
- Lorenzo, D. N., et al. Spectrin mutations that cause spinocerebellar ataxia type 5 impair axonal transport and induce neurodegeneration in Drosophila. J. Cell. Biol. 189, 143-158 (2010).
- Robinow, S., White, K. The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages. Dev. Biol. 126, 294-303 (1988).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Furst, A., Mahowald, A. P. Differentiation of primary embryonic neuroblasts in purified neural cell cultures from Drosophila. Dev. Biol. 109, 184-192 (1985).
- Salvaterra, P. M., Bournias-Vardiabasis, N., Nair, T., Hou, G., Lieu, C. In vitro neuronal differentiation of Drosophila embryo cells. J. Neurosci. 7, 10-22 (1987).
- Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. J. Cell. Biol. 136, 71-80 (1997).
- Rizzuto, R., et al. A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues. J. Biol. Chem. 264, 10595-10600 (1989).
- Poot, M., et al. Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains. J. Histochem. Cytochem. 44, 1363-1372 (1996).
- Haller, T., Dietl, P., Deetjen, P., Volkl, H. The lysosomal compartment as intracellular calcium store in MDCK cells: a possible involvement in InsP3-mediated Ca2+ release. Cell Calcium. 19, 157-165 (1996).
