FtsZ polymerisatie Testen: Eenvoudige Protocollen en overwegingen

Summary

Polymerization of FtsZ is essential for bacterial cell division. In this report, we detail simple protocols to monitor FtsZ polymerization activity and discuss the influence of buffer composition. The protocols can be used to study the interaction of FtsZ with regulatory proteins or antibacterial drugs that affect FtsZ polymerization.

Abstract

Tijdens bacteriële celdeling, het essentiële eiwit FtsZ assembleert in het midden van de cel naar het zogenaamde Z-ring. FtsZ polymeriseert in lange filamenten in aanwezigheid van GTP in vitro, en de polymerisatie wordt geregeld door verscheidene accessoire eiwitten. FtsZ polymerisatie is uitgebreid bestudeerd in vitro middels basistechnieken zoals lichtverstrooiing, sedimentatie, GTP hydrolyse assays en elektronenmicroscopie. Bufferomstandigheden invloed zowel de polymerisatie eigenschappen van FtsZ, en het vermogen van FtsZ om te interageren met regulerende eiwitten. We beschrijven hier protocollen voor FtsZ polymerisatie studies en voorwaarden en controles te valideren met behulp van Escherichia coli en Bacillus subtilis FtsZ als model eiwitten. Een lage snelheid sedimentatie test wordt ingevoerd dat de studie van de interactie van FtsZ maakt met eiwitten die bundelen of buisvormig maken FtsZ polymeren. Een verbeterde GTPase assay protocol wordt beschreven dat het testen mogelijk maaktGTP hydrolyse van de tijd met verschillende omstandigheden in een 96-well plaat opstart, met gestandaardiseerde incubatietijden dat variatie in kleurontwikkeling in de fosfaat detectiereactie schaffen. De voorbereiding van de monsters voor lichtverstrooiing studies en elektronenmicroscopie wordt beschreven. Verscheidene buffers worden gebruikt om geschikte pH en zoutconcentratie voor FtsZ polymerisatie studies stellen. Een hoge concentratie van KCl is het beste voor de meeste experimenten. Onze methoden bieden een uitgangspunt voor de in vitro karakterisatie van FtsZ, niet alleen van E. coli en B. subtilis maar van andere bacterie. Als zodanig kunnen de werkwijzen worden gebruikt voor onderzoek naar de interactie van FtsZ met regulerende proteïnen of het testen van antibacteriële geneesmiddelen die FtsZ polymerisatie kan beïnvloeden.

Introduction

De essentiële bacteriële eiwit FtsZ is de best gekarakteriseerde eiwitten van de bacteriële celdeling machines. FtsZ is de prokaryote homoloog van tubuline en polymeriseert in vitro in een GTP-afhankelijke wijze. FtsZ is een zeer aantrekkelijk doelwit voor nieuwe antibiotica vanwege de geconserveerde aard en uniciteit aan bacteriën ^1,2. Begin celdeling FtsZ vormt een cytokinetische ring midcell, dat als matrix voor de assemblage van andere celdeling proteïnes. Vorming van de Z-ring is van cruciaal belang voor een correcte lokalisatie van de divisie vlak. De assemblage dynamiek van FtsZ worden gereguleerd door verschillende accessoire eiwitten, zoals (afhankelijk van de bacteriesoort) MinC, SepF, ZapA, UgtP en EzrA ^2. FtsZ polymerisatie is intensief bestudeerd in vitro en veel verschillende structuren, waaronder rechte protofilamenten, gebogen protofilamenten, bladen van filamenten, filamentenbundels en pijpen van filamenten des geweestcribed afhankelijk van het samenstel buffer, nucleotide en bijkomende eiwitten opgenomen in de test ^3. De architectuur van FtsZ protofilamenten in vivo is nog niet volledig begrepen, hoewel elektronen cryotomography experimenten Caulobacter crescentus suggereren dat de Z-ring is samengesteld uit relatief korte, niet-continue enkele protofilamenten zonder uitgebreide bundeling ^4.

In vitro, de polymerisatie eigenschappen van FtsZ en de interactie van FtsZ met de eiwitten zijn gevoelig voor de samenstelling van de reactiebuffer. Zo Recent beschreven wij de interactie site SepF de FtsZ C-terminus en toonde dat een FtsZ _B Δ16 C-eindstandige afknotting niet langer bindt aan SepF ^5. In een eerdere studie over de SepF-FtsZ _B interactie, afkappen een soortgelijke FtsZ _B Δ16 nog cosedimented met SepF, die suggereerde dat SepF bindt aan een tweede locatie op FtsZ <sup> 6. Het verschil tussen deze studies was de samenstelling van de reactie buffers-bij pH 7.5 was er geen cosedimentation van SepF met de FtsZ afkappen, terwijl bij een pH van 6,5 was er cosedimentation. Gündoğdu et al.. opgemerkt dat SepF niet functioneel en neerslaat bij pH 6,5 ^7, waaruit blijkt dat de waargenomen cosedimentation bij pH 6,5 wordt waarschijnlijk veroorzaakt door precipitatie van SepF plaats van interactie met de FtsZ _B Δ16 C-terminale afgeknotte. De invloed van pH en KCl concentratie op de polymerisatie van FtsZ eerder onderzocht. Polymeren van E. coli FtsZ (FtsZ _Ec) bij pH 6,5 zijn langer en overvloediger dan gevormd bij neutrale pH ^8,9. Tadros et al.. de polymerisatie van FtsZ _Ec bestudeerd in aanwezigheid van monovalente kationen merken dat K ⁺ binding wordt gelinkt aan FtsZ _Ec polymerisatie en is cruciaal voor FtsZ activiteit ^10. De pH is meer critical wanneer de interactie van FtsZ met andere eiwitten bestudeerd, zoals blijkt uit het voorgaande voorbeeld van SepF en de pH afhankelijkheid van het remmende effect van MinC op FtsZ ^11. Aangezien zowel pH en zoutconcentratie de interactie van FtsZ invloed kunnen met andere eiwitten, is het belangrijk om de juiste voorwaarden en controles voor de FtsZ polymerisatie studies kiezen.

Hier beschrijven we protocollen FtsZ polymerisatie en GTPase activiteit te bestuderen door lichtverstrooiing, elektronenmicroscopie, sedimentatie, en GTPase assays. Rechte hoek lichtverstrooiing is een standaard methode om FtsZ polymerisatie studeren in real time ^12. We introduceerden een aantal verbeteringen aan de sedimentatie en GTPase test. We presenteren in detail hoe de monsters voor te bereiden op lichtverstrooiing en elektronenmicroscopie. Verschillende buffers die in de literatuur FtsZ polymerisatie studie werden getest en beschrijven we de beste voorwaarden voor elk experiment. We laten ook zien welke controles moeten wordengeïntroduceerd om de beste gegevens te verkrijgen.

Deze methoden maken een snelle studie van FtsZ polymerisatie, activiteit en interactie met andere eiwitten met behulp van eenvoudige methoden en apparatuur die beschikbaar is in de meeste laboratoria. Meer geavanceerde methoden om FtsZ polymerisatie studeren bestaan, maar vaak toegang tot meer gespecialiseerde apparatuur en / of wijzigen van FtsZ met fluorescerende labels ^8,13,14 vereisen. De eenvoudige methoden beschreven in dit document worden geïllustreerd aan de hand FtsZ van B. subtilis en E. coli, de meest voorkomende Gram + en Gram-model organismen. De protocollen kunnen worden aangepast aan andere FtsZ eiwit. Gebaseerd op inleidende tests met deze nieuwe FtsZs, kleine veranderingen over tijd, buffer of incubatietemperatuur nodig zijn voor een optimaal resultaat. De hier beschreven experimenten moeten helpen bij het vinden van deze optimale omstandigheden.

Protocol

FtsZ gelabeld eiwitten werden gezuiverd zoals eerder beschreven 11,15, gedialyseerd tegen 20 mM Tris / HCl (pH 7,9), 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 2,5 mM MgAc en 10% glycerol en bewaard bij -80 ° C. Onder deze omstandigheden kan het eiwit worden bewaard dan 2 jaar zonder significant verlies van activiteit. Het eiwit moet worden bewaard in 100 ul aliquots ontdooien en bevriezen van het monster te voorkomen. Na ontdooien kan het monster bij 4 ° C worden bewaard maximaal een week. FtsZ oplosbaar is bij hoge concentraties en kan op 7-10 mg / ml worden opgeslagen. Het is belangrijk om de eiwitconcentratie hoog te houden om ongewenste effecten van opslagbuffer componenten in latere experimenten voorkomen. Daarom moet opslagconcentratie zorgen voor een verdunning FtsZ ten minste 10x glycerol concentratie lager dan 1% te brengen en de concentratie van de andere componenten van de dialyse buffer in het reactiemengsel minimaliseren. FtsZ polymerisatie kan ook worden beïnvloed door de aanwezigheid van hoge natrium 9 </sup> of imidazol concentraties dus deze componenten dient te worden verwijderd uit de polymerisatie buffer. SepF werd gezuiverd zoals beschreven 7 en opgeslagen in elutiebuffer bij -80 ° C. Alternatieve gepubliceerde procedures voor zuivering van FtsZ van E. coli en B. subtilis en verwijzingen naar de procedures voor zuivering van FtsZ vanuit verschillende bronnen zijn samengevat in Tabel 1 (zie representatieve resultaten sectie). 1. Monstervoorbereiding Bereid polymerisatie buffers: 1 50 mM Hepes / NaOH, pH 7,5 2 25 mM PIPES / NaOH, pH 6,8 3 50 mM MES / NaOH, pH 6,5 4 50 mM Hepes / NaOH, pH 7,5, 50 mM KCl 5 25 mM PIPES / NaOH, pH 6,8, 50 mM KCl 6 50 mm MES / NaOH, pH 6,5, 50 mM KCl 7 50 mM Hepes / NaOH, pH 7,5, 300 mM KCl 8 25 mM PIPES / NaOH, pH 6,8, 300 mM KCl 9 50 mM MES / NaOH, pH 6,5, 300 mM KCl Filter steriliseren alle buffers met behulp van een 22 micrometer membraan filter. Bereid 100 mM GTP, BBP en MgCl2 voorraad oplossingen in elk polymerisatie buffer uit (1). Preclear de eiwitten door spinnen bij 100.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C voor alle experimenten. 2. FtsZ Sedimentatie Assay Bereid het reactiemengsel door toevoeging van MgCl2 en FtsZ een van de polymerisatie buffers (zie monstervoorbereiding punt 1) in buizen geschikt centrifugatie bij hoge snelheid. Totale hoeveelheid moet 49 pi zijn met MgCl2 bij 10 mM en FtsZ bij 12 uM in 50 pl eindvolume. Pkant de buis in een incubator onder schudden functie, incubeer gedurende 2 min bij 30 ° C bij 300 rpm (alternatief kan het monster worden voorzichtig aangetikt en kort microfuge gevolgd door voorverwarmen bij 30 ° C). Begin polymerisatie door toevoeging van 1 pi van GTP of BBP voorraadoplossing in dezelfde buffer zoals gebruikt in het experiment (eindconcentratie van 2 mM). Incubeer gedurende 10 min of 2 (bij buffers met 50 mM KCl en 300 mM KCl, respectievelijk) bij 30 ° C bij 300 rpm (of in een incubator met schudden functie). Breng de buizen een ultracentrifuge rotor en spin beneden voor 10 min bij 350.000 xg (89.700 rpm gedurende TLA 120.1 rotor) bij 25 ° C. Na het spinnen, voorzichtig de buizen uit de rotor en onmiddellijk Breng de bovenste in een schone buis. Bereid monsters voor SDS-PAGE door het toevoegen van 20 pl supernatant aan 20 ui 2x monsterbuffer. Kook gedurende 10 minuten bij 98 ° C. Voeg 50 ul van 2x monsterbuffer de pellet fractie bevattende FtsZ polymeren. Plaats de ultracentrifuge buis in een 2 ml buis. Resuspendeer de pellet door koken gedurende 10 minuten bij 98 ° C, voeg 50 pl gedemineraliseerd H2O het monster dezelfde 2x verdunning de supernatant monster maken. Draai de ultracentrifuge buis ondersteboven in de 2 ml buis en spin down gedurende 5 minuten in een Eppendorf centrifuge bij 18.000 x g. Verwijder de ultracentrifuge buis van de 2 ml buis. Belasting 10 pi van elke supernatant en pellet monster naast elkaar op een 10% SDS-PAGE gel. Voer de gel bij 150 V. Vlekken op de gel met Coomassie Brilliant Blue G-250 en bewaar ze voor kwantificering. 3. FtsZ Sedimentatie Assay bij Slow Spin Bereid polymerisatie oplossing zoals in stap 2, voeg SepF en / of FtsZ (eindconcentratie 12 uM). Deze experimenten kunnen worden uitgevoerd in Beckman disposable 1,5 ml buizen in combinatie met een TLA-55 rotor. Plaats de buis in een incubator met schudden functies en incubeer gedurende 2 min bij 30 ° C bij 300 rpm. Begin polymerisatie door de toevoeging van 1 pi van GTP of BBP van een voorraadoplossing (eindconcentratie 2 mM), incubeer gedurende 20 minuten bij 30 ° C bij 300 rpm. Spin down gedurende 15 min bij 24.600 xg (20.000 rpm voor TLA 55 rotor) bij 25 ° C. Verwijder de bovenstaande vloeistof en breng in een schone buis worden 20 ul en breng in 20 ui 2x monsterbuffer. Kook gedurende 10 minuten bij 98 ° C. Voeg 50 ul van 2x monsterbuffer om fractie pellet bevattende polymeren en resuspendeer door koken gedurende 10 minuten bij 98 ° C, voeg 50 pl gedemineraliseerd H2O Belasting 10 pi van elke supernatant en pellet monster naast elkaar op een 10% SDS-PAGE gel. Voer de gel bij 150 V. Vlekken op de gel met Coomassie Brilliant Blue G-250 en bewaar ze voor kwantificering. 4. Kwantificering van de FtsZ Sedimentatie Testen Maak een foto van de Coomassie stained gel met behulp van een gel-documentatiesysteem (bv. LAS-4000, Fujifilm). Open het imago van de gel in een programma geschikt is voor densitometrische analyse van gels (bv. AIDA beeldanalysator programma (RAYTEST)) en beschrijf analyse in dit programma hieronder. Klik op de "Evaluatie" knop in de werkbalk. Selecteer de "2D Densitometrie" uit de lijst en klik op OK. In het hoofdmenu, klik op "Evaluatie" en kies de "Regio Bepaling" entry. Om een ​​regio op de gel maken, klikt u op het symbool van Auto-contour gereedschap in de regio Bepaling toolbox. Klik in de linkerbovenhoek van het eiwit band op de gel, houd de muisknop ingedrukt en sleep het naar de gewenste rechter einde van de band en laat de muisknop los. Mark elk FtsZ / SepF band op dezelfde manier. Alle informatie over de evaluatie van de toegewezen regio's vindt u in de regio Report. Om de Regio verkrijgenn Report, klik op de "Show regio Report" knop in de regio Bepaling toolbox. Om het rapport te exporteren, in het hoofdmenu, klik op Bestand en kies "Exporteren à 2D Regio Report" entry. In de regio verslag, moet de intensiteit van ieder geschapen regio te vinden. Bereken het percentage eiwit (FtsZ, regulerend eiwit) in de pellet met de intensiteitswaarden van het verslag. 5. 90 ° lichtverstrooiing Zet een fluorescentie spectrometer (bijv. AMINCO-Bowman Series 2), zodat de lamp op te warmen gedurende enkele minuten om de thermische schommelingen te vermijden en zet een circulerend waterbad om de cuvet kamer temperatuur op 30 ° C te houden Definieer de operationele parameters van de spectrometer: detector hoge spanning 300 V, emissie en excitatie golflengte: 350 nm, spleetbreedte: 4 nm. Merk op dat veel spectrometers het signaal automatisch aanpassen aan het begin van een experiment om een ​​certain percentage (bijvoorbeeld 60%) van de maximale. Dit veroorzaakt een scatter signaal om te gaan buiten bereik zodra GTP wordt toegevoegd aan polymeriseren FtsZ. Het is verstandig om eerst de juiste signaalversterking-detector hoogspanning-voor maximale polymerisatie tot stand brengen voordat het starten van een reeks experimenten. Programmeer een data-acquisitie protocol. Kies op tijd gebaseerde overname, met een looptijd van 3600 sec. Zorgvuldig schoonmaken een fluorescentie cuvet met water en ethanol, eventueel-ultrasone trillingen in een waterbad bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. In dit protocol werden cuvetten met een weglengte van 1 cm en een volume van 200 ul gebruikt en opgeslagen opslagoplossing (0,5-1% Hellmanex). Als alternatief kan eenmalig gebruik UV-compatibel plastic cuvetten (UVette, Eppendorf) worden gebruikt. Bereid 294 ul van een master mix van de polymerisatie buffer (zie monstervoorbereiding punt 1) met 10 mM MgCl2 en 12 uM FtsZ als uiteindelijke concentratie berekend voor 300 ul, en vortex. Breng 196 pi van de polymerisatie buffer om de cuvet en plaats deze in spectrometer. Incubeer gedurende 2 minuten bij 30 ° C. Start de data-acquisitie en wacht 90 seconden om te controleren of het signaal stabiel is. Voeg 4 pi van 100 mM GTP of BNP (eindconcentratie 2 mM) tot een uiteindelijk reactievolume van 200 ul bereiken pipet op en neer met een groter volume pipet te mengen en opnieuw acquisitie. 6. Transmissie Elektronen Microscopie Bereid monsters voor de FtsZ sedimentatie assay (het volume kan worden verminderd tot 10 ui eindvolume materiaal slaan). Na de incubatietijd dien 2 pl van het monster in een gloed ontladen 400 mesh met koolstof beklede koperen rooster, incubeer gedurende 15 sec. Dep het net droog door voorzichtig aan te raken of te slepen het net parallel of loodrecht op een stuk filtreerpapier. Vlekken op het rooster met 4 ui van een 2% uranyl-acetaat oplossing. Blot het net droog als beschreven in stap 6.3. Bekijk het rooster in een Philips CM120 elektronenmicroscoop werkend bij 120 kV bij 39.200 X vergroting. 7. GTP hydrolyse Assay De opzet van het experiment is ontworpen zodanig dat GTP hydrolyse van FtsZ wordt na verscheidene reactietijden door mengen van het reactiemengsel met malachietgroen. Zo tijde van de kleurontwikkeling malachietgroen is hetzelfde voor elk monster. Bereid 1,5 ml 2 mM GTP in een van de polymerisatie buffers (zie monstervoorbereiding, punt 1). Bereid een 0-40 uM fosfaat standaard oplossing in een polymerisatie buffer en bereid malachietgroen be reagens zoals beschreven in de POMG-25H (bioassays) kit. Als alternatief kan de actieve reagentia worden bereid in eigen huis volgens de protocollen beschreven door Lanzetta et al.. 16 Bereid mastermengsels in een totaal volume van 360 pi: <tableborder = "1"> Ik 24 uM FtsZ B, 20 mM MgCl2, polymerisatie buffer II 12 uM FtsZ Ec, 20 mM MgCl2, polymerisatie buffer III (controle 1) 24 uM FtsZ B, 2 mM EDTA, polymerisatie buffer IV (controle 2) 12 uM FtsZ Ec, 2 mM EDTA, polymerisatie buffer Pipetteer 20 ul aliquots van de mastermengsels, 100 ul fosfaat standaarden en 180 ul 2 mM GTP in een qPCR 96-wells plaat in de volgende volgorde: Een B C D E F G H 1 III III Ik Ik IV IV </td> II II 2 III III Ik Ik IV IV II II 3 III III Ik Ik IV IV II II 4 III III Ik Ik IV IV II II 5 III III Ik Ik IV IV II II 6 III III Ik Ik IV IV II II 7 III III Ik Ik IV IV II II </ Tr> 8 III III Ik Ik IV IV II II 9 PS PS PS PS PS PS PS PS 10 PS PS PS PS PS PS PS PS 11 12 GTP GTP GTP GTP GTP GTP GTP GTP PS – fosfaat standaard Plaats de qPCR plaat in een PCR-machine met de ingesteld op 40 min cyclus bij 30 ° C programma Bereid 20 pi aliquots van malachite groene werken reagens in een 96-wells plaat. Voeg 60 ul van de buffer polymerisatie van het experiment lanen 1'-8 '. Het monster wordt verdund 4x vergeleken met de fosfaat-standaard, kunt u overwegen dit feit tijdens de laatste berekeningen. Een B C D E F G H 1 ' III III Ik Ik IV IV II II 2 ' III III Ik Ik IV IV II II 3 ' III III Ik Ik IV IV II II 4 ' <td> III III Ik Ik IV IV II II 5 ' III III Ik Ik IV IV II II 6 ' III III Ik Ik IV IV II II 7 ' III III Ik Ik IV IV II II 8 ' III III Ik Ik IV IV II II 9 ' PS PS PS PS PS PS PS PS 10 ' PS </td> PS PS PS PS PS PS PS Voeg 20 ul van GTP naar baan 1, pipet op en neer te mengen, start timer (dit is de starttijd punt voor de 30 min reactie). Na 10 min, 30 sec toevoegen GTP naar baan 2, pipet op en neer te mengen (20 min reactie). Na 16 min toevoegen GTP naar baan 3, pipet op en neer te mengen (15 min reactie). Na 21 min, 30 sec toevoegen GTP naar baan 4, pipet op en neer om te mengen (10 min reactie). Na 25 min toevoegen GTP naar baan 5, pipet op en neer te mengen (7 min reactie). Na 27 min, 30 sec toevoegen GTP naar baan 6, pipet op en neer te mengen (5 min reactie). Na 29 min toevoegen GTP naar baan 7, pipet op en neer te mengen (4 min reactie) .. Na 30 min overdracht 20 ul van baan 1 naar baan 1 ', pipet op en neer te mengen (beginpunt van malachietgroen kleur ontwikkeling voor de 30 min reactie). Na 30 min, 30 sec overdracht 20 ul van rijstrook 2-2 ', pipet op en neer te mengen (beginpunt van malachietgroen kleur ontwikkeling voor de 20 min reactie). Herhaal deze stap voor de lanen 3-7 om de 30 sec. Na 33 min, 30 sec voeg 20 ul van GTP naar baan 8, pipet op en neer om te mixen en te dragen 20 pl naar baan 8 ', pipet op en neer te mengen (0 min reactie en starttijd punt voor malachietgroen kleur ontwikkeling voor de reactie). Na 34 min toe 80 ul van rijstrook 9-9 ', pipet op en neer te mengen (de starttijd punt voor malachietgroen kleur ontwikkeling voor de fosfaat standaard 1). Na 34 min 30 sec overdracht 80 ul van rijstrook 10 tot 10 ', pipet op en neer te mengen (de starttijd punt voor malachietgroen kleur ontwikkeling voor de fosfaat standaard 2). Verwijder alle luchtbellen uit de monsters en incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende nogmaals 25 min30 sec. Plaats de plaat in 96-well plaatlezer. Na 60 min meten de plaat 10x elke 30 sec bij golflengte 630 nm (malachietgroen kleur ontwikkeling is nu 30 minuten voor de eerste reactie). Elke meting komt overeen met elke tijdstip van stappen 7,6-7,12 en 7,16 en moet apart worden berekend tijdens een data-analyse. Bereken het vrije fosfaat in elk monster met behulp van de fosfaat standaardijkkromme. Plot de gegevens als fosfaat vrijkomen in de tijd, en bereken de FtsZ GTP hydrolyse activiteit van het lineaire bereik van de curve.

Representative Results

Purification of FtsZ from different bacterial sources has been described in the literature and is summarized in Table 1. Source Method Modification Yield obtained [mg/L of culture]> References B. subtilis 1) Ammonium sulfate precipitation/ion exchange chromatography no 40 This work, 11,15 2) Affinity chromatography His-tag ND 17 E. coli 1) Ammonium sulfate precipitation/ion exchange chromatography no 35 This work, 11,15 2) Calcium precipitation, ion exchange chromatography no 40 18 Methanococcus jannaschii 1) Affinity chromatography under denaturing conditions/refolding/ammonium sulfate precipitation/gel filtration His-tag 1.3 19 2) Affinity chromatography/ gel filtration His-tag ND 20 Thermotoga maritima Ion exchange chromatography/gel filtration no 6.7 19 Pseudomonas aeruginosa Affinity chromatography/gel filtration Strep-tag, His-tag ND 21 Mycobacterium tuberculosis 1) Affinity/ion exchange chromatography no ND 22 2) Affinity chromatography/ gel filtration no 30 23 Aquifex aeolicus Affinity chromatography/gel filtration His-tag, C-terminal truncation (331-367) ND 24 Caulobacter crescentus Ion exchange chromatography/ammonium sulfate precipitation/gel filtration no ND 25 Table 1. FtsZ purification protocols described. ND: not determined. Sedimentation of FtsZ polymers Initially, we used two different velocities to spin down FtsZ polymers. We found that only at a velocity of 350,000 x g single polymers of FtsZEc are spun down (Figure 1) whereas at 190,000 x g only bundles of FtsZBs are present in the pellet fraction (data not shown). Therefore 350,000 x g was used in our further experiments. The percentage of polymerized FtsZEc and FtsZBs is similar at 50 mM KCl even though the light scattering experiments revealed a much higher scattering signal for FtsZBs. This is due to bundles formed by FtsZBs which scatter more light than single polymers of FtsZEc. It was not possible to obtain high amount of FtsZ polymers in the pellet fraction in the experiment with 300 mM KCl for both FtsZEc and FtsZBs (Figure 1). We attribute this to a combination of quick disassembly of the FtsZ structures and decreased bundling of the filaments. Sedimentation of FtsZ-SepF tubules To analyze the interaction of FtsZ with certain activators sedimentation assays can be performed at lower centrifugation speeds. At this velocity only large structures of FtsZ may be pelleted, e.g. the large tubules formed by SepF rings and FtsZBs filaments5, or the bundles formed by FtsZ and ZapA. We used lower centrifugation (24,600 x g) to demonstrate the feasibility of this approach for the tubules formed by FtsZ and SepF. FtsZ was recovered in the pellet above background levels only when both SepF and GTP were present in the sample (Figure 2), and the presence of SepF does not influence FtsZ GTPase activity7 showing that FtsZ is fully active in the presence of SepF. Specific sedimentation of SepF and FtsZ is roughly 45% of total SepF and 15% of total FtsZ (compared to material sedimenting when GDP is added). This shows that the SepF-FtsZ tubules contain more SepF than FtsZ. This may be because many SepF rings organize the FtsZ-SepF tubules5,7. The exact stoichiometry of SepF-FtsZ in these tubules is not known but our results suggest that there is more SepF present than FtsZ. FtsZEc and FtsZBs polymerization and bundling properties To characterize the polymerization efficiency of FtsZBs and FtsZEc in different buffers we analyzed both proteins by 90° angle light scattering. At 50 mM KCl, FtsZBs gives a 20-40-fold higher light scattering signal than FtsZEc depending on buffer pH (Figures 3A and B) confirming results of Buske et al.26 Increasing the KCl concentration in the buffer did not significantly influence the light scattering signal of FtsZEc (Figure 3D) but the signal of FtsZBs decreased ~80-fold at pH 7.5, ~30-fold at pH 6.8 and ~45-fold at pH 6.5 in 300 mM KCl (Figure 3C) compared to buffers with 50 mM KCl (Figure 3A). Disassembly of FtsZ polymers is faster at higher KCl concentration for both proteins (Figures 3C and D). Studies of Pacheco-Gómez et al. show that E. coli FtsZ polymerization and bundling is pH dependent. These authors found that in a buffer with 50 mM KCl the light scattering signal of FtsZ polymerization was higher, and disassembly of FtsZ took longer at pH 6.0 compared to pH 7.0 8. These results are not in agreement with our data from polymerization of FtsZEc at 50 mM KCl (Figure 3B), but it has to be noted that we have used three different buffers (HEPES, MES and PIPES) where Pacheco-Gómez et al. only used MES. Thus, not only the pH, but also buffer composition (ionic strength) affects the kinetics of FtsZ polymers at 50 mM KCl. However, at 300 mM KCl neither buffer composition nor pH influenced FtsZEc assembly in a detectable manner. A light scattering experiment of FtsZBs in buffers without KCl was not possible due to precipitation of the protein under these conditions. When the concentration of FtsZBs was lowered to 3 µM, precipitation did not occur. However, 3 µM is not the physiological concentration of FtsZ in the cell. In plastic cuvettes, FtsZBs did not precipitate at 12 µM at pH 7.5, but at pH 6.8 and 6.5 FtsZ still precipitated in the absence of KCl. Morphologies of FtsZ structures from E. coli and B. subtilis The structures formed by FtsZ were inspected by TEM. FtsZBs assembled into closely compacted polymers that covered the whole grid in all buffers at low salt (Figures 4A-C). FtsZEc formed long filaments, cables and bundles in all buffers at low salt (Figures 4D-F). However, the observable amount of polymers formed by FtsZEc was lower than the amount formed by FtsZBs. In high salt buffers FtsZBs formed longer single-stranded protofilaments which did not associate into bundles (Figures 4G-I). While FtsZBs protofilaments changed structure at higher salt concentration, FtsZEc formed structures indistinguishable from those of low salt buffer (Figures 4J-L). There was no observable pH influence on polymerization of FtsZEc but FtsZBs forms more bundles at pH 6.5 which are visible as closely compacted polymers and sheets (Figure 4B). These results are in accord with our light scattering experiments and previously published TEM work8,11,26. The GTPase activity of FtsZ at high and low KCl concentrations The GTP hydrolysis activity of FtsZ was measured under different conditions using a colorimetric assay for free phosphate. As reported previously15 the GTPase activity of FtsZ increased with increasing KCl concentration: depending on the buffer used FtsZBs. showed a 3-7 fold increase, and FtsZEc showed a 1.5-2.5 fold increase in GTPase activity at 300 mM KCl compared to 50 mM KCl. The reduced GTPase activity at 50 mM KCl is due to bundling of FtsZBs filaments. At 50 mM KCl FtsZEc had a 3-6 fold higher GTPase activity than FtsZBs due to quicker disassembly of the FtsZEc polymers. The difference in GTP hydrolysis activity between FtsZBs and FtsZEc was reduced at 300 mM KCl, possibly because of reduced bundling of FtsZBs filaments (Figure 5). Figure 1. Quantification of FtsZ polymerization by sedimentation. (A) 12 µM FtsZ was polymerized in the presence of 2 mM GTP or GDP at pH 7.5 (black bars), 6.8 (grey bars) or 6.5 (white bars). The amount of protein pelleted was determined by densitometric analysis of Coomassie stained gels. GDP served as a control for a specific sedimentation and the percentage of FtsZ sedimented with GDP was subtracted from the percentage of FtsZ sedimented with GTP to obtain the values plotted in the graph. On the left: FtsZ sedimented at 50 mM KCl, on the right: FtsZ sedimented at 300 mM KCl. (B) Representative results from Coomassie stained gels. Polymerization of FtsZBs (upper gel) and FtsZEc (lower gel) at 50 mM KCl. (S) supernatant, (P) pellet fractions from the experiment. Click here to view larger image. Figure 2. Sedimentation of SepF/FtsZ tubules at low speed. (A) 12 µM FtsZBs was polymerized with 2 mM GDP (white bars) or GTP (black bars). The amount of protein pelleted was determined by densitometric analysis of Coomassie stained gels. The + and – signs under the x-axis indicate the presence or absence of FtsZ and SepF in the reaction. (B) Representative results from a Coomassie stained gel. Polymerization of FtsZBs in the presence and absence of SepF. As a control SepF without FtsZ was used. Polymerization was carried out with GTP and GDP. (S) supernatant, (P) pellet fractions from the experiment. Click here to view larger image. Figure 3. Light scattering of 12 μM FtsZEc and 12 μM FtsZBs. FtsZs were assembled in the presence of 2 mM GTP and polymerization was monitored by 90° angle light scattering. Polymerization of FtsZBs (A) and FtsZEc (B) at 50 mM KCl at pH 7.5, pH 6.8, pH 6.5. Polymerization of FtsZBs (C) and FtsZEc (D) at 300 mM KCl at pH 7.5, pH 6.8 and pH 6.5. Click here to view larger image. Figure 4. Structures of FtsZBs and FtsZEc polymers visualized by electron microscopy. (A-L) Images of 12 µM FtsZBs (A-C and G-I) and FtsZEc (D-F) and (J-L) polymerized with 2 mM GTP. (A-C) FtsZBs in buffer with 50 mM KCl and pH 7.5, 6.8, and 6.5 respectively. (D-F) FtsZEc in buffer with 50 mM KCl and pH 7.5, 6.8, and 6.5 respectively. (G-I) FtsZBs in buffer with 300 mM KCl and pH 7.5, 6.8, and 6.5 respectively. (J-L) FtsZEc in buffer with 300 mM KCl and pH 7.5, 6.8, and 6.5 respectively. Scale bar: 100 nm. Click here to view larger image. Figure 5. GTP hydrolysis during FtsZ polymerization in 6 different buffers. In all experiments 2 mM GTP was used. As a control sample with no MgCl2 was used. Activity of FtsZ without MgCl2 was subtracted from the activity of FtsZ in the presence of MgCl2. On the left: GTPase activity of FtsZ at 50 mM KCl, on the right: GTPase activity of FtsZ at 300 mM KCl. Click here to view larger image.

Discussion

We describe a set of methods that allows a quick analysis of FtsZ activity and its interaction with other proteins. Light scattering, sedimentation and GTPase assays as well as electron microscopy have been widely used to study FtsZ polymerization. We have made some improvements to existing protocols, we showed the influence of different conditions on FtsZ assembly, and we propose controls that should be included in FtsZ studies.

We introduce low speed centrifugation to distinguish large structures formed by the association between FtsZ and its interacting proteins from FtsZ polymers. This method shows two advantages over the standard sedimentation assay. First, no background is formed by the FtsZ polymers in the pellet fraction as they are not spun down at 24,600 x g. Second, the amount of FtsZ present in the structure formed with an interacting protein may be calculated from the gel. Two critical steps in this method are the incubation time and the GTP concentration. It is important to centrifuge the large protein structure when it is complete but before it disassembles when all GTP is hydrolyzed. The best control for this study is polymerization of FtsZ with GDP. There is one potential limitation of the assay. FtsZ forms a stable complex with SepF, which can easily be spun down at 24,600 x g. If the sedimentation with another activator or a drug that bundles FtsZ polymers is performed, it may be necessary to adapt the assay. It may be done by changing the incubation time, or increasing the speed of centrifugation.

Proper preparation of the sample is the most important for light scattering experiments. Proteins must be precleared by spinning and all the buffers should be filtered prior to use. If any aggregates are present in the sample, they will disrupt a stable signal obtained from FtsZ polymers. For the analysis of the FtsZ structures by electron microscopy, preparation of a grid is the main step. The time of sample incubation on the grid will have the effect of producing more or less compacted polymers. For bundles of FtsZ_Bs, the time of incubation must be shorter than for FtsZ_Ec and FtsZ_Bs at high KCl concentration. We used a concentration of 12 µM for every sample to be able to compare the results. However, for FtsZ_Bs at 50 mM KCl a lower FtsZ concentration should be used, as 12 µM resulted in a full saturation of the grid. This makes the polymers highly compacted and difficult to detect. Less compacted polymers are better to detect on EM.

The GTPase assay is the only experiment used to study the activity rather than the structures of FtsZ. Mg²⁺ is necessary for GTP turnover in FtsZ polymers. Thus, in the absence of Mg²⁺, FtsZ does not hydrolyze GTP. Therefore, a sample with no Mg²⁺ is the right control in this assay but cations of Mg are present in the FtsZ storage buffer. They may be removed by addition of 1 mM EDTA to the control sample. The critical step in this assay is the incubation time. It is important to stop FtsZ activity after a given time. This is achieved by transferring the FtsZ sample to a malachite green solution in a 96-well plate. However, development of the malachite green color is a continuous process. Thus the measurements must be taken at the same time for every sample. Using a well-planned GTP addition protocol with measurements taken each 30 sec apart in an established order, it is possible to obtain the same incubation and sample handling time for every time point. Another critical step is choosing the concentration of the protein for the experiment. In the experiment we used two different concentrations for FtsZ_Ec and FtsZ_Bs. GTP hydrolysis is much quicker for FtsZ_Ec compared to FtsZ_Bs. The GTPase activity of FtsZ_Ec under chosen conditions and at 12 µM is linear only for maximum 5 min and after that time the hydrolysis rate plateaus. Thus, it is difficult to interpret data from the experiment when performed under these conditions. In this case FtsZEc must be used at lower concentration than FtsZ_Bs to be able to compare activities of both proteins. The GTPase activity of FtsZs from different sources may vary. Thus, the right concentration must be chosen. The concentration for FtsZ polymerization should be well above the critical concentration (in general from 2.5-10 µM). The dynamics of FtsZ assembly and disassembly is also important. Some proteins show a significant lag in polymerization after addition of GTP, as shown for FtsZBs at 50 mM KCl. It is useful to perform the light scattering assay before the GTPase assay to approximate the time of assembly and disassembly of FtsZ polymers. After that, the time of incubation and concentration of protein may be chosen. Since the conditions chosen for FtsZ polymerization are crucial, it is important to use the right pH and KCl concentration in each method. In this work we studied 9 different buffers with pH ranging from 6.5-7.5 and KCl concentrations from 0 M to 300 mM. We noticed that the best condition to analyze FtsZs from B. subtilis and E.coli and their biological activity is at pH that is close to physiological level (7.5) together with a high KCl concentration. At a high KCl concentration, FtsZ has a higher GTPase activity and produces polymers that are better detectable by electron microscopy. We also confirmed that the physiological pH and a high KCl concentration are better for the study of the interaction between FtsZ and regulatory proteins than any other buffers mostly used to study FtsZ assembly. FtsZBs shows a similar activity to FtsZEc when studied at high KCl concentration. In addition, at low salt concentration the influence of pH is more visible than in the buffers with high salt concentration. FtsZ sometimes precipitates when using buffers without KCl, as a result, buffers without salt should be avoided. Sedimentation of FtsZ polymers is low when using buffers with high KCl concentrations. This may be an advantage when studying interactions between FtsZ and proteins that assemble FtsZ filaments such as SepF and ZapA as these higher order structures are easy to detect with centrifugation. In all our experiments we used MgCl₂ at a 10 mM concentration. It was shown that a relatively high Mg²⁺ concentration stabilizes FtsZ polymers and reduces the GTPase activity of FtsZ. In Table 2 results from various studies are summarized describing FtsZ polymerization and GTPase activity at different Mg²⁺ concentrations using otherwise identical buffer conditions ²⁷. The measured concentration of free cytoplasmic Mg²⁺ is 0.9 mM³. It should be noticed that GTP will chelate an equivalent amount of Mg²⁺. Thus, the optimal Mg²⁺ concentration for GTPase experiments is around 2-2.5 mM, which is close to physiological level³. However, in our experiments we used MgCl₂ at a 10 mM concentration to obtain an easily detectable light scattering signal and to stabilize FtsZ polymers during the sedimentation assay.

Although we applied our protocols to FtsZ from the model organisms E. coli and B. subtilis, they can be adapted to FtsZ from any other organism. It has to be noted that the physiological pH, and concentrations of monovalent, and divalent cations differ among organisms. Thus, the optimal conditions for FtsZ polymerization may vary. Differences in doubling time and growth conditions of different bacteria may result in different assembly kinetics of FtsZ and optimal conditions of the experiments. However, our protocol provides a good starting point for the experiments with FtsZs from other organisms. The protocols should be useful for the study of FtsZ with regulatory proteins or the study of effects of small compounds and drugs on FtsZ.

Source	Polymerization [% of FtsZ sedimented]	GTPase [Pi/FtsZ/min]	Mg2+ concentration [mM]	FtsZ concentration [µM]	References
FtsZEc	~ 28%	~ 2.1	10	12	This work
	~ 50%	~ 2.4	10	12.5	27
	~ 43%	~ 3.5	5	12.5	27
	~ 27%	~ 4.6	2.5	12.5	27
	ND	~ 5.4	2.5	5	26
FtsZBs	~ 30%	~ 0.8		12	This work
	~ 52% (with DEAE dextran)	~ 0.5	10	10	11
	ND	~ 2.25	2.5	5	26

Table 2. Effect on Mg²⁺ on FtsZ polymerization and GTPase. Results from this work compared to published data. All experiments were carried out in 50 mM MES/ NaOH, pH=6.5, 50 mM KCl.

Materials

GTP	Roche	10106399001	Part 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
Thickwall Polycarbonate Tubes	Beckman Coulter	343776	Part 2
Optima MAX-XP Ultracentrifuge	Beckman Coulter	393315	Part 2, 3
Polyallomer Tube with Snap-on Cap	Beckman Coulter	357448	Part 3
AIDA Bio-package, 1D, 2D, FL	Raytest Isotopenmessgeräte GmbH	15000001	Part 4
Luminescence Image Analyzer LAS-4000	Fujifilm		Part 4
Thermo Spectronic AMINCO-Bowman Luminescence Spectrometer	Spectronic Instruments		Part 5
Fluorescence Cell	Hellma Analytics	105-250-15-40	Part 5
Square 400 Mesh, Copper, 100/vial	Electron Microscopy Sciences	G400-Cu	Part 6
CM120 Electron Microscope Operating at 120 kV	Philips		Part 6
96 ml x 0.2 ml Plate	BIOplastics	B70501	Part 7
Malachite Green Phosphate Assay Kit	BioAssay System	POMG-25H	Part 7
PowerWave HT Microplate Spectrophotometer	BioTek		Part 7