Abstract
במהלך חלוקת תא חיידק, FtsZ החלבון החיוני מרכיב באמצע של התא כדי ליצור את מה שנקרא Z-הטבעת. FtsZ polymerizes לחוטים ארוכים בנוכחות GTP במבחנה, ופילמור מוסדר על ידי מספר חלבוני אבזר. פילמור FtsZ נחקר בהרחבה במבחנה באמצעות שיטות בסיסיות כוללים פיזור אור, שקיעה, מבחני הידרוליזה GTP ומיקרוסקופ אלקטרונים. שני מאפייני השפעת תנאי חיץ פילמור של FtsZ, ואת היכולת של FtsZ לאינטראקציה עם חלבונים רגולטוריים. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים ללימודי פילמור FtsZ ולאמת את התנאים ושולטים באמצעות Escherichia coli וsubtilis Bacillus FtsZ חלבונים דגם. Assay שקיעת מהירות נמוכה הוא הציג שמאפשר הלימוד של האינטראקציה של FtsZ עם חלבונים שחבילה או tubulate פולימרים FtsZ. פרוטוקול assay GTPase השתפר מתואר המאפשר בדיקותשל הידרוליזה GTP לאורך זמן באמצעות תנאים שונים בהתקנת צלחת 96 היטב, עם זמני דגירה סטנדרטיים הלבטל וריאציה בהתפתחות צבע בתגובה לגילוי פוספט. הכנת דגימות ללימודי פיזור אור ומיקרוסקופ אלקטרונים מתוארת. כמה מאגרים המשמשים להקמת ה-pH המתאים חיץ וריכוז מלח ללימודי פילמור FtsZ. ריכוז גבוה של KCl הוא הטוב ביותר עבור רוב הניסויים. השיטות שלנו מספקות נקודה מוצא למבחנת האפיון בשל FtsZ, לא רק מE. coli ו-B subtilis אבל מכל חיידק אחר. ככזה, השיטות יכולות לשמש למחקרים על האינטראקציה של FtsZ עם חלבונים רגולטוריים או הבדיקה של תרופות אנטיבקטריאליות אשר עשוי להשפיע פילמור FtsZ.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
GTP | Roche | 10106399001 | Part 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 |
Thickwall Polycarbonate Tubes | Beckman Coulter | 343776 | Part 2 |
Optima MAX-XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | Part 2, 3 |
Polyallomer Tube with Snap-on Cap | Beckman Coulter | 357448 | Part 3 |
AIDA Bio-package, 1D, 2D, FL | Raytest Isotopenmessgeräte GmbH | 15000001 | Part 4 |
Luminescence Image Analyzer LAS-4000 | Fujifilm | Part 4 | |
Thermo Spectronic AMINCO-Bowman Luminescence Spectrometer | Spectronic Instruments | Part 5 | |
Fluorescence Cell | Hellma Analytics | 105-250-15-40 | Part 5 |
Square 400 Mesh, Copper, 100/vial | Electron Microscopy Sciences | G400-Cu | Part 6 |
CM120 Electron Microscope Operating at 120 kV | Philips | Part 6 | |
96 ml x 0.2 ml Plate | BIOplastics | B70501 | Part 7 |
Malachite Green Phosphate Assay Kit | BioAssay System | POMG-25H | Part 7 |
PowerWave HT Microplate Spectrophotometer | BioTek | Part 7 |
References
- Haydon, D. J., Stokes, N. R., et al. An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity. Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).
- Adams, D. W., Errington, J. Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring. Nat. Rev. Microbiol. 7 (9), 642-653 (2009).
- Erickson, H. P., Anderson, D. E., Osawa, M. FtsZ in bacterial cytokinesis: cytoskeleton and force generator all in one. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (4), 504-528 (2010).
- Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division. EMBO J. 26 (22), 4694-4708 (2007).
- Król, E., van Kessel, S. P., van Bezouwen, L. S., Kumar, N., Boekema, E. J., Scheffers, D. J. Bacillus subtilis SepF binds to the C-terminus of FtsZ. PLoS One. 7 (8), e43293 (2012).
- Singh, J. K., Makde, R. D., Kumar, V., Panda, D. SepF increases the assembly and bundling of FtsZ polymers and stabilizes FtsZ protofilaments by binding along its length. J. Biol. Chem. 283 (45), 31116-31124 (2008).
- Gündoğdu, M. E., Kawai, Y., et al. Large ring polymers align FtsZ polymers for normal septum formation. EMBO J. 30 (3), 617-626 (2011).
- Pacheco-Gomez, R., Roper, D. I., Dafforn, T. R., Rodger, A. The pH dependence of polymerization and bundling by the essential bacterial cytoskeletal protein FtsZ. PLoS One. 6 (6), e19369 (2011).
- Mendieta, J., Rico, A. I., Lopez-Vinas, E., Vicente, M., Mingorance, J., Gomez-Puertas, P. Structural and functional model for ionic (K(+)/Na(+)) and pH dependence of GTPase activity and polymerization of FtsZ, the prokaryotic ortholog of tubulin. J. Mol. Biol. 390 (1), 17-25 (2009).
- Tadros, M., Gonzalez, J. M., Rivas, G., Vicente, M., Mingorance, J. Activation of the Escherichia coli cell division protein FtsZ by a low-affinity interaction with monovalent cations. FEBS Lett. 580 (20), 4941-4946 (2006).
- Scheffers, D. J. The effect of MinC on FtsZ polymerization is pH dependent and can be counteracted by ZapA. FEBS Lett. 582 (17), 2601-2608 (2008).
- Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations. J. Bacteriol. 181 (3), 823-832 (1999).
- Chen, Y., Erickson, H. P. Rapid in vitro assembly dynamics and subunit turnover of FtsZ demonstrated by fluorescence resonance energy transfer. J. Biol. Chem. 280 (23), 22549-22554 (2005).
- Hou, S., Wieczorek, S. A., et al. Characterization of Caulobacter crescentus FtsZ protein using dynamic light scattering. J. Biol. Chem. 287 (28), 23878-23886 (2012).
- Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. Dynamic assembly of FtsZ regulated by GTP hydrolysis. EMBO J. 17 (2), 462-469 (1998).
- Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Anal. Biochem. 100 (1), 95-97 (1979).
- Ray, S., Kumar, A., Panda, D. GTP regulates the interaction between MciZ and FtsZ: a possible role of MciZ in bacterial cell division. Biochemistry. 52 (2), 392-401 (2013).
- Rivas, G., Lopez, A., et al. Magnesium-induced linear self-association of the FtsZ bacterial cell division protein monomer. The primary steps for FtsZ assembly. J. Biol. Chem. 275 (16), 11740-11749 (2000).
- Oliva, M. A., Cordell, S. C., Lowe, J. Structural insights into FtsZ protofilament formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (12), 1243-1250 (2004).
- Lowe, J., Amos, L. A. Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ. Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).
- Cordell, S. C., Robinson, E. J., Lowe, J. Crystal structure of the SOS cell division inhibitor SulA and in complex with FtsZ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (13), 7889-7894 (2003).
- Chen, Y., Anderson, D. E., Rajagopalan, M., Erickson, H. P. Assembly dynamics of Mycobacterium tuberculosis FtsZ. J. Biol. Chem. 282 (38), 27736-27743 (2007).
- White, E. L., Ross, L. J., Reynolds, R. C., Seitz, L. E., Moore, G. D., Borhani, D. W. Slow polymerization of Mycobacterium tuberculosis FtsZ. J. Bacteriol. 182 (14), 4028-4034 (2000).
- Oliva, M. A., Trambaiolo, D., Lowe, J. Structural insights into the conformational variability of FtsZ. J. Mol. Biol. 373 (5), 1229-1242 (2007).
- Thanbichler, M., Shapiro, L. M. ipZ. a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter. Cell. 126 (1), 147-162 (2006).
- Buske, P. J., Levin, P. A. Extreme C terminus of bacterial cytoskeletal protein FtsZ plays fundamental role in assembly independent of modulatory proteins. J. Biol. Chem. 287 (14), 10945-10957 (2012).
- Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations. J. Bacteriol. 181 (3), 823-832 (1999).