Polymerization of FtsZ is essential for bacterial cell division. In this report, we detail simple protocols to monitor FtsZ polymerization activity and discuss the influence of buffer composition. The protocols can be used to study the interaction of FtsZ with regulatory proteins or antibacterial drugs that affect FtsZ polymerization.
I løpet av bakteriell celledeling, samler det vesentlige protein FtsZ i midten av cellen for å danne den såkalte Z-ring. FtsZ polymeriserer i lange filamenter i nærvær av GTP in vitro, og polymeriseringen reguleres av flere aksessoriske proteiner. FtsZ polymerisasjon har blitt grundig studert in vitro ved hjelp av grunnleggende metoder inkludert lysspredning, sedimentering, GTP hydrolyse analyser og elektronmikroskopi. Buffer forholdene påvirker både polymerisasjonsproduktene egenskaper FtsZ, og evnen til FtsZ å samhandle med regulatoriske proteiner. Her beskriver vi protokoller for FtsZ polymeriseringsbetingelser studier og validere forhold og kontroller ved hjelp av Escherichia coli og Bacillus subtilis FtsZ som modell proteiner. En lav hastighet sedimente analysen er innført som gjør studiet av samspillet FtsZ med proteiner som bunter eller tubulate FtsZ polymerer. En forbedret GTPase analyseprotokollen er beskrevet som tillater testingGTP hydrolyse over tid ved bruk av ulike forhold i en 96-brønn plate-oppsett, med standardiserte inkubasjonstider som avskaffe variasjon i fargeutvikling i fosfat deteksjon reaksjonen. Fremstilling av prøver for lysspredning studier og elektronmikroskopi, er beskrevet. Flere buffere blir benyttet for å etablere passende buffer pH og saltkonsentrasjon for FtsZ polymeri-studier. En høy konsentrasjon av KCl er de beste for de fleste eksperimenter. Våre metoder gir et utgangspunkt for den in vitro karakterisering av FtsZ, ikke bare fra E. coli-og B. subtilis, men fra en annen bakterie. Dermed kan fremgangsmåtene anvendes for studier av interaksjonen mellom FtsZ med regulatoriske proteiner eller testing av antibakterielle midler som kan påvirke FtsZ polymerisasjon.
Den essensielle bakterielle protein FtsZ er best karakterisert proteinet av den bakterielle celledelingen maskineri. FtsZ er den prokaryote homolog av tubulin og polymeriserer in vitro i en GTP avhengig måte. FtsZ er et svært attraktivt mål for nye antibiotika på grunn av sin bevart natur og egenart til bakterier 1,2. Ved begynnelsen av celledeling, danner FtsZ en cytokinetic ring ved midcell, som tjener som et stillas for montering av andre celledeling proteiner. Dannelse av den Z-ringen er viktig for korrekt lokalisering av divisjonen planet. Monterings dynamikken i FtsZ er regulert av flere tilbehørs proteiner, slik som (avhengig av bakteriearter) Minc, SepF, Zapa, UgtP, og Ezra to. FtsZ polymerisasjon har blitt nøye studert in vitro og mange forskjellige strukturer, inkludert rette protofilaments, buede protofilaments, ark med filamenter, bunter av filamenter og rør av filamenter har vært desbert avhengig av sammenstillingen buffer, nukleotid, og ytterligere proteiner som er inkludert i analysen, 3.. Arkitekturen i FtsZ protofilaments in vivo er ennå ikke fullt ut forstått, selv om elektron cryotomography eksperimenter i Caulobacter crescentus tyder på at Z-ring er satt sammen av relativt korte, ikke-kontinuerlig enkelt protofilaments uten omfattende bunting fire.
In vitro, de polymeri-egenskaper FtsZ og interaksjonen mellom FtsZ med regulatoriske proteiner er følsomme for sammensetningen av reaksjonsbufferen. For eksempel, vi nylig beskrevet samspillet stedet for SepF på FtsZ C-terminalen og viste at en FtsZ B Δ16 C-terminal avkorte ikke lenger binder seg til SepF fem. I en tidligere studie på SepF-FtsZ Bs interaksjon, avkorte en lignende FtsZ B Δ16 fortsatt cosedimented med SepF, som antydet at SepF binder seg til et sekundært område på FtsZ <sup> 6. Forskjellen mellom disse studiene var sammensetningen av reaksjons-buffere ved pH 7,5 var det ingen cosedimentation av SepF med FtsZ truncate, mens ved pH 6,5 ble det cosedimentation. Gündoğdu et al. bemerkes at SepF ikke er funksjonell og utfelles ved pH 6,5 7, som viser at den observerte cosedimentation ved pH 6,5 er sannsynligvis å være forårsaket av utfelling av SepF fremfor interaksjon med FtsZ B Δ16 C-terminale truncate. Innflytelsen av pH-og KCl-konsentrasjon på polymerisasjonen av FtsZ tidligere har vært undersøkt. Polymerer av E. coli FtsZ (FtsZ EF) ved pH 6,5 er lengre og rikere enn de som dannes ved nøytral pH 8,9. Tadros et al. har studert polymerisasjon av FtsZ Ec i nærvær av monovalente kationer merke seg at K + binding er knyttet til FtsZ Ec polymerisasjon og er avgjørende for FtsZ aktivitet 10. PH-verdien er mer critical ved interaksjonen av FtsZ med andre proteiner er studert, som vist ved den foregående eksempel på SepF, og pH-avhengighet av den hemmende effekten av MiNC on FtsZ 11.. Som både pH og saltkonsentrasjon kan påvirke samspillet av FtsZ med andre proteiner, er det viktig å velge de rette forholdene og kontroller for de FtsZ polymerisasjonsforsøk studier.
Her beskriver vi protokoller for å studere FtsZ polymerisasjon og GTPase aktivitet ved lysspredning, elektronmikroskopi, sedimentering, og GTPase analyser. Rettvinklet lysspredning er en standardmetode for å studere FtsZ polymerisasjon i sanntid 12.. Vi har innført en del forbedringer i sedimentering og GTPase assay. Vi presenterer i detalj hvordan å forberede prøvene for lysspredning, og elektronmikroskopi. Mange buffere som brukes i litteraturen for å studere FtsZ polymerisasjonen ble testet, og vi beskriver de beste betingelser for hvert forsøk. Vi viser også som styrer bør væreintrodusert for å oppnå de beste dataene.
Disse fremgangsmåter tillater en rask undersøkelse av FtsZ polymerisasjon, aktivitet og interaksjon med andre proteiner ved hjelp av enkle metoder og utstyr som er tilgjengelig i de fleste laboratorier. Mer sofistikerte metoder for å studere FtsZ polymerisasjon eksisterer, men krever ofte tilgang til mer spesialisert utstyr, og / eller modifisering av FtsZ med fluorescerende etiketter 8,13,14. De enkle metodene som beskrives i denne artikkelen er illustrert ved hjelp FtsZ fra B. subtilis og E. coli, den mest vanlige Gram + og Gram-modellorganismer. Protokollene kan tilpasses til en hvilken som helst annen FtsZ protein. Basert på foreløpige analyser med disse romanen FtsZs, små endringer vedrørende tid, buffer eller Inkubasjonstemperaturen kan være nødvendig for et optimalt resultat. Forsøkene som er beskrevet her bør hjelpe til å finne disse optimale betingelser.
We describe a set of methods that allows a quick analysis of FtsZ activity and its interaction with other proteins. Light scattering, sedimentation and GTPase assays as well as electron microscopy have been widely used to study FtsZ polymerization. We have made some improvements to existing protocols, we showed the influence of different conditions on FtsZ assembly, and we propose controls that should be included in FtsZ studies.
We introduce low speed centrifugation to distinguish large structures formed by the association between FtsZ and its interacting proteins from FtsZ polymers. This method shows two advantages over the standard sedimentation assay. First, no background is formed by the FtsZ polymers in the pellet fraction as they are not spun down at 24,600 x g. Second, the amount of FtsZ present in the structure formed with an interacting protein may be calculated from the gel. Two critical steps in this method are the incubation time and the GTP concentration. It is important to centrifuge the large protein structure when it is complete but before it disassembles when all GTP is hydrolyzed. The best control for this study is polymerization of FtsZ with GDP. There is one potential limitation of the assay. FtsZ forms a stable complex with SepF, which can easily be spun down at 24,600 x g. If the sedimentation with another activator or a drug that bundles FtsZ polymers is performed, it may be necessary to adapt the assay. It may be done by changing the incubation time, or increasing the speed of centrifugation.
Proper preparation of the sample is the most important for light scattering experiments. Proteins must be precleared by spinning and all the buffers should be filtered prior to use. If any aggregates are present in the sample, they will disrupt a stable signal obtained from FtsZ polymers. For the analysis of the FtsZ structures by electron microscopy, preparation of a grid is the main step. The time of sample incubation on the grid will have the effect of producing more or less compacted polymers. For bundles of FtsZBs, the time of incubation must be shorter than for FtsZEc and FtsZBs at high KCl concentration. We used a concentration of 12 µM for every sample to be able to compare the results. However, for FtsZBs at 50 mM KCl a lower FtsZ concentration should be used, as 12 µM resulted in a full saturation of the grid. This makes the polymers highly compacted and difficult to detect. Less compacted polymers are better to detect on EM.
The GTPase assay is the only experiment used to study the activity rather than the structures of FtsZ. Mg2+ is necessary for GTP turnover in FtsZ polymers. Thus, in the absence of Mg2+, FtsZ does not hydrolyze GTP. Therefore, a sample with no Mg2+ is the right control in this assay but cations of Mg are present in the FtsZ storage buffer. They may be removed by addition of 1 mM EDTA to the control sample. The critical step in this assay is the incubation time. It is important to stop FtsZ activity after a given time. This is achieved by transferring the FtsZ sample to a malachite green solution in a 96-well plate. However, development of the malachite green color is a continuous process. Thus the measurements must be taken at the same time for every sample. Using a well-planned GTP addition protocol with measurements taken each 30 sec apart in an established order, it is possible to obtain the same incubation and sample handling time for every time point. Another critical step is choosing the concentration of the protein for the experiment. In the experiment we used two different concentrations for FtsZEc and FtsZBs. GTP hydrolysis is much quicker for FtsZEc compared to FtsZBs. The GTPase activity of FtsZEc under chosen conditions and at 12 µM is linear only for maximum 5 min and after that time the hydrolysis rate plateaus. Thus, it is difficult to interpret data from the experiment when performed under these conditions. In this case FtsZEc must be used at lower concentration than FtsZBs to be able to compare activities of both proteins. The GTPase activity of FtsZs from different sources may vary. Thus, the right concentration must be chosen. The concentration for FtsZ polymerization should be well above the critical concentration (in general from 2.5-10 µM). The dynamics of FtsZ assembly and disassembly is also important. Some proteins show a significant lag in polymerization after addition of GTP, as shown for FtsZBs at 50 mM KCl. It is useful to perform the light scattering assay before the GTPase assay to approximate the time of assembly and disassembly of FtsZ polymers. After that, the time of incubation and concentration of protein may be chosen. Since the conditions chosen for FtsZ polymerization are crucial, it is important to use the right pH and KCl concentration in each method. In this work we studied 9 different buffers with pH ranging from 6.5-7.5 and KCl concentrations from 0 M to 300 mM. We noticed that the best condition to analyze FtsZs from B. subtilis and E.coli and their biological activity is at pH that is close to physiological level (7.5) together with a high KCl concentration. At a high KCl concentration, FtsZ has a higher GTPase activity and produces polymers that are better detectable by electron microscopy. We also confirmed that the physiological pH and a high KCl concentration are better for the study of the interaction between FtsZ and regulatory proteins than any other buffers mostly used to study FtsZ assembly. FtsZBs shows a similar activity to FtsZEc when studied at high KCl concentration. In addition, at low salt concentration the influence of pH is more visible than in the buffers with high salt concentration. FtsZ sometimes precipitates when using buffers without KCl, as a result, buffers without salt should be avoided. Sedimentation of FtsZ polymers is low when using buffers with high KCl concentrations. This may be an advantage when studying interactions between FtsZ and proteins that assemble FtsZ filaments such as SepF and ZapA as these higher order structures are easy to detect with centrifugation. In all our experiments we used MgCl2 at a 10 mM concentration. It was shown that a relatively high Mg2+ concentration stabilizes FtsZ polymers and reduces the GTPase activity of FtsZ. In Table 2 results from various studies are summarized describing FtsZ polymerization and GTPase activity at different Mg2+ concentrations using otherwise identical buffer conditions 27. The measured concentration of free cytoplasmic Mg2+ is 0.9 mM3. It should be noticed that GTP will chelate an equivalent amount of Mg2+. Thus, the optimal Mg2+ concentration for GTPase experiments is around 2-2.5 mM, which is close to physiological level3. However, in our experiments we used MgCl2 at a 10 mM concentration to obtain an easily detectable light scattering signal and to stabilize FtsZ polymers during the sedimentation assay.
Although we applied our protocols to FtsZ from the model organisms E. coli and B. subtilis, they can be adapted to FtsZ from any other organism. It has to be noted that the physiological pH, and concentrations of monovalent, and divalent cations differ among organisms. Thus, the optimal conditions for FtsZ polymerization may vary. Differences in doubling time and growth conditions of different bacteria may result in different assembly kinetics of FtsZ and optimal conditions of the experiments. However, our protocol provides a good starting point for the experiments with FtsZs from other organisms. The protocols should be useful for the study of FtsZ with regulatory proteins or the study of effects of small compounds and drugs on FtsZ.
Source | Polymerization [% of FtsZ sedimented] | GTPase [Pi/FtsZ/min] | Mg2+ concentration [mM] | FtsZ concentration [µM] | References |
FtsZEc | ~ 28% | ~ 2.1 | 10 | 12 | This work |
~ 50% | ~ 2.4 | 10 | 12.5 | 27 | |
~ 43% | ~ 3.5 | 5 | 12.5 | 27 | |
~ 27% | ~ 4.6 | 2.5 | 12.5 | 27 | |
ND | ~ 5.4 | 2.5 | 5 | 26 | |
FtsZBs | ~ 30% | ~ 0.8 | 12 | This work | |
~ 52% (with DEAE dextran) | ~ 0.5 | 10 | 10 | 11 | |
ND | ~ 2.25 | 2.5 | 5 | 26 |
Table 2. Effect on Mg2+ on FtsZ polymerization and GTPase. Results from this work compared to published data. All experiments were carried out in 50 mM MES/ NaOH, pH=6.5, 50 mM KCl.
The authors have nothing to disclose.
Work in our laboratory is funded by a VIDI grant from the Netherlands Organisation for Scientific research (to DJS). We thank Marc Stuart and the Department of Electron Microscopy at our university, for assistance with and providing access to the transmission electron microscope.
GTP | Roche | 10106399001 | Part 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 |
Thickwall Polycarbonate Tubes | Beckman Coulter | 343776 | Part 2 |
Optima MAX-XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | Part 2, 3 |
Polyallomer Tube with Snap-on Cap | Beckman Coulter | 357448 | Part 3 |
AIDA Bio-package, 1D, 2D, FL | Raytest Isotopenmessgeräte GmbH | 15000001 | Part 4 |
Luminescence Image Analyzer LAS-4000 | Fujifilm | Part 4 | |
Thermo Spectronic AMINCO-Bowman Luminescence Spectrometer | Spectronic Instruments | Part 5 | |
Fluorescence Cell | Hellma Analytics | 105-250-15-40 | Part 5 |
Square 400 Mesh, Copper, 100/vial | Electron Microscopy Sciences | G400-Cu | Part 6 |
CM120 Electron Microscope Operating at 120 kV | Philips | Part 6 | |
96 ml x 0.2 ml Plate | BIOplastics | B70501 | Part 7 |
Malachite Green Phosphate Assay Kit | BioAssay System | POMG-25H | Part 7 |
PowerWave HT Microplate Spectrophotometer | BioTek | Part 7 |