FtsZは重合アッセイ：シンプルプロトコルと考慮事項

Summary

Polymerization of FtsZ is essential for bacterial cell division. In this report, we detail simple protocols to monitor FtsZ polymerization activity and discuss the influence of buffer composition. The protocols can be used to study the interaction of FtsZ with regulatory proteins or antibacterial drugs that affect FtsZ polymerization.

Abstract

細菌の細胞分裂の間、必須タンパク質のFtsZは、いわゆるZ-環を形成して、セルの中央に組み立てる。 FtsZは、 インビトロで GTPの存在下で長いフィラメントに重合し、重合は、いくつかのアクセサリータンパク質により調節される。 FtsZの重合は、広範囲に光散乱、沈降、GTP加水分解アッセイおよび電子顕微鏡法などの基本的な方法を用いてインビトロで研究されてきた。バッファー条件の影響は、両方のFtsZの重合特性、および調節タンパク質と相互作用するためのFtsZの能力。ここでは、FtsZの重合研究のためのプロトコルを記述し、モデルタンパク質として大腸菌、枯草菌のFtsZを使用して条件とコントロールを検証します。低速沈降アッセイは、バンドルまたはFtsZの重合体をチューブ状のタンパク質とのFtsZの相互作用の研究を可能に導入される。改良されたGTPアーゼアッセイプロトコルは、テストを可能に記載されているリン酸検出反応での発色の変化を廃止し、標準化インキュベーション時間を有する96ウェルプレートセットアップにおいて、種々の条件を用いて経時的にGTP加水分解。光散乱試験および電子顕微鏡観察用試料の調製が記載されている。複数のバッファは、FtsZの重合の研究に適した緩衝液pHおよび塩濃度を確立するために使用される。塩化カリウム高濃度の実験のほとんどのための最善の方法です。我々の方法は、E.からだけでなく、のFtsZ のインビトロ特徴付けのための出発点を提供大腸菌とB枯草菌が、他の細菌から。このように、本方法は、調節タンパク質またはFtsZの重合に影響を与える可能性抗菌薬のテストとのFtsZの相互作用の研究のために使用することができる。

Introduction

必須の細菌タンパク質FtsZは、細菌の細胞分裂機構の最もよく特徴付けられたタンパク質である。 FtsZは、チューブリンの原核生物相同体であるとGTP依存的にin vitroで重合する。 FtsZは、細菌^の1,2への保存された自然や独自性のために新しい抗生物質のために非常に魅力的な標的である。細胞分裂の開始時に、FtsZは、他の細胞分裂タンパク質の組み立てのための足場として働くmidcellにおける細胞質分裂の環を形成する。 Z-環の形成は、分割面の正しい位置特定のために重要である。のFtsZの組立ダイナミクスは、MINC、SepF、ZapA、UgtP、エズラ^2（細菌種に応じて）など、いくつかのアクセサリータンパク質によって調節されています。 FtsZの重合は、インビトロで集中的に研究されており、直プロトフィラメント、湾曲したプロトフィラメント、フィラメントのシート、フィラメントのフィラメント、チューブの束を含む多くの異なる構造がデスされている組立バッファ、ヌクレオチド、およびアッセイ³に含まれている追加のタンパク質に依存しcribed。 カウロバクターのクレセンタスにおける電子cryotomography実験は、Zリングが豊富な^4をバンドルすることなく、比較的短い、非連続シングルプロトフィラメントから組み立てられていることを示唆しているが、生体内でのFtsZのプロトフィラメントのアーキテクチャは、まだ完全には理解されていません。

in vitroでは 、FtsZの重合特性及び調節タンパク質とのFtsZの相互作用は、反応バッファーの組成に敏感である。例えば、我々は最近、FtsZのC末端にSepFための相互作用部位を説明し、FtsZは_宿泊 Δ16C末端TRUNCATEはもはやSepF ⁵に結合することが示されなかった。 SepF-FtsZは_宿泊の相互作用に関するこれまでの研究では、同様のFtsZ _宿泊 Δ16はまだSepFがFtsZの上のセカンダリサイトに結合することが示唆されSepFとcosedimentedとtruncate <suP> 6。これらの研究の違いは、pH7.5でバッファ – のFtsZとSepFのない共沈降は、pH6.5の共沈降があったのに対し、切り捨てるありませんでした。反応の組成物であった。 Gündoğdu ら 。 SepFが機能していないし、pH 6.5で観察共沈降がSepFの析出はなく、FtsZの_宿泊 Δ16C末端TRUNCATEとの相互作用によって引き起こされる可能性が高いことを示し、pH6.5の⁷に析出と指摘した。のFtsZの重合に対するpHおよびKCl濃度の影響は、以前に検討されている。 EのポリマーpH6.5で大腸菌のFtsZ（FtsZは_EC）は 、より長く、より豊富な中性pH ^8,9で形成されたものよりも。 Tadros ら 。バインディングのK ^+が FtsZの_Ecの重合にリンクされ、FtsZは活動¹⁰のために重要であることは注目に一価の陽イオンの存在下でのFtsZ _のEcの重合を検討した。 pHがよりcriticaですSepFの前の例、およびFtsZは^11日 MINCの抑制効果のpH依存性で示すように、他のタンパク質とのFtsZの相互作用は、検討されているL。 pHおよび塩濃度の両方が他のタンパク質とのFtsZの相互作用に影響を及ぼし得るように、FtsZの重合試験のための適切な条件およびコントロールを選択することが重要である。

ここでは、光散乱、電子顕微鏡、沈降、およびGTPアーゼアッセイによりFtsZの重合およびGTPase活性を研究するためのプロトコルを記述します。直角光散乱は、即座に¹² FtsZの重合を研究するための標準的な方法である。私たちは、沈降およびGTPアーゼアッセイ、数の改善を導入しました。我々は、光散乱および電子顕微鏡用の試料を調製する方法を詳細に述べる。 FtsZの重合を研究する文献で使用されるいくつかのバッファがテストされ、我々は、各実験のための最高の条件を説明した。我々はまたあるべきかを制御示して最適なデータを得るために導入した。

これらのメソッドは、ほとんどの実験室で提供され、簡単な方法および装置を使用して他のタンパク質とのFtsZの重合活性および相互作用の迅速な研究を可能にする。 FtsZの重合を研究するより洗練された方法が存在するが、多くの場合、蛍光標識^8,13,14とのより専門的な機器へのアクセス、および/ ​​またはFtsZのの修正が必要。このホワイトペーパーで説明の簡単な方法は、BからのFtsZを使用して説明している枯草菌および大腸菌大腸菌 、最も一般的なグラム陽性およびグラムモデル生物。プロトコルは、他のFtsZタンパク質に適合させることができる。これらの新規FtsZsによる予備アッセイに基づいて、インキュベーション時間、緩衝液または温度に関するわずかな変化は、最適な結果のために必要であり得る。ここに記載された実験は、これらの最適な条件を見つけるのに役立つはずです。

Protocol

タグなしのFtsZタンパク質は、先に説明したように11,15 20mMトリス/塩酸（pH 7.9）、50mMのKCl、1mMのEGTA、2.5mMのMgAc及び10％グリセロールに対して透析し、精製し、そして-80℃で保存した。これらの条件下でタンパク質活性の有意な損失なしに2年以上保存することができる。タンパク質は解凍し、サンプルの凍結を回避するために、100μlアリコートに格納する必要があります。解凍後、サンプルは最大一週間4℃で保持することができる。 FtsZは、高濃度で可溶性であり、7〜10 mg / mlので保存することができる。これは、後の実験における貯蔵緩衝成分の望ましくない影響を回避するために、高タンパク質濃度を維持することが重要である。そこで、ストレージ濃度は少なくとも10倍、1％以下のグリセロール濃度をもたらすために、反応混合物中の透析緩衝液の他の成分の濃度を最小にするためののFtsZの希釈を可能にするはずである。 FtsZの重合はまた、高ナトリウム9の存在によって影響され得る</suP>またはイミダゾールの濃度は、このように、これらのコンポーネントは、重合バッファから削除する必要があります。 7記載の-80℃での溶出バッファに格納されているようにSepFを精製したEからのFtsZの精製の ​​ための代替公表された手順大腸菌とB枯草菌ならびに異なる供給源からのFtsZの精製の ​​ための手順への参照は、（代表的な結果のセクションを参照） を表1にまとめる。 1。試料調製重合バッファを準備します。 1 50mMのHepes / NaOHでpHを7.5 2 25 mMのパイプ/ NaOHでpHを6.8 3 50 mMのMES / NaOHでpHを6.5 4 50mMのHepes / NaOHを、pHが7.5、50mMのKCl 5 25 mMのパイプ/ NaOHでpHを6.8、50のKCl 6 50 mMの男ES / NaOHでpHを6.5、50のKCl 7 50mMのHepes / NaOHを、pHが7.5、300 mMのKClを 8 25 mMのパイプ/ NaOHでpHを6.8; 300のKCl 9 50 mMのMES / NaOHでpHを6.5; 300のKCl フィルター22ミクロンのメンブランフィルターを用いてすべてのバッファを殺菌。 （1）からの各重合液中100mMのGTP、GDPとのMgCl 2ストック溶液を準備します。 全ての実験のために4℃で20分間、100,000×gでスピンによるタンパク質プリ·クリアー。 2。 FtsZは沈降アッセイ高速遠心分離と互換性のあるチューブで（試料調製ポイント1を参照）の重合バッファの1にMgCl 2およびFtsZはを加えることにより反応ミックスを調製する。総体積は50μlの最終容量で、12μMで10 mmとMgCl 2およびFtsZのと、49μLにする必要があります。 P、関数を振盪インキュベーター中でチューブレース300rpmで30℃で2分間インキュベートする（あるいは試料を穏やかに弾き飛ばされてもよいし、短時間、30℃で予熱に続いて微量遠心）。 GTPまたは実験（最終濃度2mM）で用いたのと同じ緩衝液中のGDPのストック溶液1μlを添加することにより重合を開始。 300回転（または関数を振とう培養器内）で30℃、（それぞれ、50のKClおよび300mMのKClをバッファーなど）10、または2分間インキュベートします。 超遠心ローターにチューブを移し、25℃で35万XG（TLA 120.1ローター用89700 rpm）で10分間スピンダウン紡糸後、慎重にロータからチューブを取り外し、すぐにきれいなチューブに上清を移す。 2Xサンプルバッファー20μlに20μlの上清を添加することにより、SDS-PAGE用サンプルを準備します。 98℃で10分間沸騰させるフォートを含むペレット画分に2×試料緩衝液50μlを追加SZポリマー。 2ミリリットルチューブに超遠心管を配置します。 98℃で10分間煮沸してペレットを再懸濁し、サンプル上清サンプルと同じ2倍希釈するために、脱イオンH 2 Oを50μlを加える。 2ミリリットルチューブに逆さまに超遠心管を回して、18,000 X gでエッペンドルフ遠心機で5分間スピンダウン。 2ミリリットル管から超遠心管を取り外します。 負荷10％SDS-PAGEゲル上で並べて各上清およびペレット試料側を10μl。 150 Vでゲルを実行クマシーブリリアントブルーG-250でゲルを染色し、定量化のために保管してください。 3。スロースピンでのFtsZ沈降アッセイステップ2のように重合溶液を準備し、SepFおよび/またはFtsZは（最終濃度12μM）を追加します。これらの実験は、TLA-55ローターと組み合わせてベックマン使い捨て1.5mlチューブ中で行うことができる。 FUを振とうしながら培養器にチューブをnctionおよび300rpmで30℃で2分間インキュベートする。 ストック溶液（最終濃度2 mM）のからのGTPまたはGDPの追加1μLにより重合を開始し、300 rpmで30℃で20分間インキュベートする。 25℃で24,600×gで（TLA 55ローター、20,000 rpm）で15分間スピンダウン上清を除去し、清潔なチューブに移す、20μLを取り、2×試料緩衝液20μlに移す。 98℃で10分間沸騰させる脱イオンH 2 O50μlのを追加し、98℃で10分間煮沸することによりポリマーおよび再懸濁を含む画分をペレット化し、2Xサンプルバッファー50μLを追加負荷10％SDS-PAGEゲル上で並べて各上清およびペレット試料側を10μl。 150 Vでゲルを実行クマシーブリリアントブルーG-250でゲルを染色し、定量化のために保管してください。 4。 FtsZは沈降アッセイの定量化クマシーSTAの写真を撮るゲルドキュメンテーションシステム（ 例えば 、LAS-4000、富士フイルム）を使用して、INEDゲル。 ゲルのデンシトメトリー分析するのに適したプログラム（ 例えば AIDA画像解析プログラム（Raytest））でゲル画像を開いて、以下のプログラムで分析を説明します。 ツールバーの「評価」ボタンをクリックしてください。 リストから「2Dデンシトメトリー」を選択し、[OK]をクリックします。 メインメニューで、「評価」をクリックして、「領域判定」エントリを選択します。 ゲル上の領域を作成するには、領域判定ツールボックスの自動輪郭ツールのシンボルをクリックしてください。 、ゲル上のタンパク質バンドの左上隅をクリックし、マウスボタンを押したまま、バンドの所望の右下端にドラッグし、マウスボタンを離します。 マークと同じ方法で、各のFtsZ / SepFバンド。 割り当てられた領域の評価に関するすべての情報は、領域レポートに記載されています。レジオを入手するにはNレポートは、領域判定ツールボックスの「表示領域レポート」ボタンをクリックしてください。 レポートをエクスポートするには、メインメニューの[ファイル]をクリックし、エントリ「2D領域レポートàエクスポート」を選択します。 地域レポートでは、すべての作成された領域の強度が見つかるはず。レポートからの強度値を用いて、ペレット中のタンパク質のパーセント（FtsZの、調節タンパク質）を算出する。 5。 90°光散乱蛍光分光計（ 例えば AMINCO-ボーマンシリーズ2）の電源を入れ、ランプは30℃でのキュベット室温度を維持するために熱変動を回避し、循環水浴をオンにするのに数分間ウォームアップすることができます分光器の動作パラメータを定義します。検出器の高電圧300 V、発光および励起波長：350 nmのスリット幅：4 nmの。多くの分光器が自動的にcertAに実験開始時に信号を調整することに注意してください最大の割合（ 例えば 60％）である。これは、すぐに、GTPがFtsZのを重合するために追加されているように範囲外に移動するための散乱信号を発生します。これは、最初の一連の実験を開始する前に、右信号増幅検出器の高電圧に対する最大の重合を確立することが賢明です。 データ収集プロトコルをプログラムします。 3600秒の持続時間、時間ベースの取得を選択します。 5分間、室温の水浴に必要 – 超音波処理した場合、水とエタノールとの蛍光キュベットを丁寧に清掃してください。このプロトコルでは、1cmの経路長及び200μlの容積を有するキュベットが使用され、貯蔵溶液（0.5〜1％のHellmanex）に格納される。代替として、単回使用の適合性プラスチックUVキュベット（UVette、エッペンドルフ）を使用することができる。 最終的な300μLに対して計算濃度、およびVORTとして10 MgCl 2および12μMのFtsZはと（サンプル調製ポイント1を参照）の重合バッファのマスターミックスの294μLを準備EX。 キュベットに重合バッファー196μLを移し、分光器に入れてください。 30℃で2分間インキュベートする。 データ収集を開始し、信号が安定していることを確認するために90秒間待ちます。 100のGTPまたはGDP（最終濃度：2 mm）で4μl加え200μlの最終反応容量を達成するために、買収をミックスして再開するより大きな容量ピペットで上下にピペット。 6。透過型電子顕微鏡 （ボリュームは、材料を節約するために、10μlの最終容量を削減することができる）のFtsZ沈降アッセイ用としてサンプルを準備します。 インキュベーション時間の後、グロー放電さ400メッシュの炭素被覆銅グリッド上に試料を2μLを適用し、15秒間インキュベートする。 優しくグリッド並列または濾紙に垂直に触れたりドラッグ​​して、グリッド乾燥ブロット。 2％の酢酸ウラニル溶液を4μLを使用してグリッドを染色。 BLOステップ6.3で説明したように、グリッドのドライT。 39200倍の倍率で120 kVので動作するフィリップスCM120電子顕微鏡グリッドを表示します。 7。 GTP加水分解アッセイ実験の設定は、FtsZのGTPの加水分解はマラカイトグリーンとの反応物を混合することにより、種々の反応時間後に停止されるように設計されている。このようにして、マラカイトグリーンの発色の時間は、各試料について同じである。 重合バッファの1つに1.5ミリリットル2のGTPを準備します（サンプル調製、ポイント1を参照）。 重合液中の0-40μMリン酸標準希釈液を調製し、POMG-25H（バイオアッセイ）キットで説明したようにマラカイトグリーンの作業試薬を調製。あるいは、作業試薬はLanzetta らによって記載されたプロトコルに従って社内で調製することができる。16 総量360μlのマスターミックスを準備します。 <table国境= "1"> 私 24μMのFtsZ BS、20のMgCl 2、重合液 2 12μMのFtsZ EC、20のMgCl 2、重合液 III（コントロール1） 24μMのFtsZ BS、2mMのEDTA、重合液 IV（コントロール2） 12μMのFtsZ EC、2mMのEDTA、重合液ピペットマスターミックス、100μlのリン酸基準や定量PCR 96ウェルプレート中2のGTP180μlを20μlのアリコートを次の順序で。 A B C言語 D E F G H 1 3 3 私私 4 4 </TD> 2 2 2 3 3 私私 4 4 2 2 3 3 3 私私 4 4 2 2 4 3 3 私私 4 4 2 2 5 3 3 私私 4 4 2 2 6 3 3 私私 4 4 2 2 7 3 3 私私 4 4 2 2 </ TR> 8 3 3 私私 4 4 2 2 9 PS PS PS PS PS PS PS PS 10 PS PS PS PS PS PS PS PS 11 12 GTP GTP GTP GTP GTP GTP GTP GTP PS – リン酸標準 30℃で40分間周期に設定されたプログラムでPCR機で定量PCRプレートを置き malac20μlのアリコートを準備96ウェルプレート中のハイト緑色作業試薬。 1'-8 'レーンの実験から、重合液の60μlを加える。サンプルは、リン酸標準と比較4Xに希釈され、最終的な計算中に、この事実を考慮してください。 A B C言語 D E F G H 1 ' 3 3 私私 4 4 2 2 2 ' 3 3 私私 4 4 2 2 3 ' 3 3 私私 4 4 2 2 4 ' <TD> III 3 私私 4 4 2 2 5 ' 3 3 私私 4 4 2 2 6 ' 3 3 私私 4 4 2 2 7 ' 3 3 私私 4 4 2 2 8 ' 3 3 私私 4 4 2 2 9 ' PS PS PS PS PS PS PS PS 10 ' PS </td> PS PS PS PS PS PS PS （これは30分の反応の開始時点で）、1レーンへのGTPの20μl加えピペットを上下に混合する、タイマーを開始します。 10分後、30秒、2レーンへのGTPを追加ピペットを上下（20分反応）を混合する。 16分後に上下3、ピペット混合する（15分反応）レーンにGTPを追加します。 21分後、30秒（10分反応）をミックスするには、上下4、ピペットをレーンにGTPを追加します。 25分後（7分反応）混合する、ピペットを上下5レーンへのGTPを追加します。 27分後、30秒（5分反応）をミックスするには、上下6、ピペットをレーンにGTPを追加します。 29分後（4分の反応）を混合する、ピペットを上下7レーンへのGTPを追加.. レーン1にレーン1から30分の転送を20μlの後で、上下のピペット混合する（3マラカイトグリーンの発色の出発点0分反応）。 30分後、30〜2レーン2から秒の転送20μL '、ピペットを上下（20分の反応のためにマラカイトグリーンの発色の開始点）を混合する。 レーン3-7ごとに30秒間のステップを繰り返します。 33分後、30秒のために（マラカイトグリーンの発色のための0分の反応と開始時点を混合するピペットを上下、8レーンへのGTP20μlのピペットを上に追加して、ミックスダウンすると「8レーンに20μLを転送反応）。 34分後、「レーン9〜9を上下にピペット混合する（リン酸標準1用のマラカイトグリーンの発色の開始時点）を80μLを加える。 34分30秒の転送80μlの後には、上下車線から10から10 '、ピペット混合する（リン酸標準2用のマラカイトグリーンの発色の開始時点）。 サンプルから全ての気泡を除去し、さらに25分間室温でプレートをインキュベート30秒。 96ウェルプレートリーダーでプレートを置き。 60分後（マラカイトグリーンの発色は、最初の反応のために今30分である）、波長630 nmでプレート10倍ごとに30秒を測定します。すべての測定は、ステップ7.6から7.12と7.16からのすべての時点に対応し、データ解析の際に別々に計算しなければなりません。 リン酸標準較正曲線を用いて各サンプル中の遊離リン酸を計算する。 時間をかけてリン酸の放出などのデータをプロットし、曲線の直線範囲からのFtsZのGTP加水分解活性を計算します。

Representative Results

Purification of FtsZ from different bacterial sources has been described in the literature and is summarized in Table 1. Source Method Modification Yield obtained [mg/L of culture]> References B. subtilis 1) Ammonium sulfate precipitation/ion exchange chromatography no 40 This work, 11,15 2) Affinity chromatography His-tag ND 17 E. coli 1) Ammonium sulfate precipitation/ion exchange chromatography no 35 This work, 11,15 2) Calcium precipitation, ion exchange chromatography no 40 18 Methanococcus jannaschii 1) Affinity chromatography under denaturing conditions/refolding/ammonium sulfate precipitation/gel filtration His-tag 1.3 19 2) Affinity chromatography/ gel filtration His-tag ND 20 Thermotoga maritima Ion exchange chromatography/gel filtration no 6.7 19 Pseudomonas aeruginosa Affinity chromatography/gel filtration Strep-tag, His-tag ND 21 Mycobacterium tuberculosis 1) Affinity/ion exchange chromatography no ND 22 2) Affinity chromatography/ gel filtration no 30 23 Aquifex aeolicus Affinity chromatography/gel filtration His-tag, C-terminal truncation (331-367) ND 24 Caulobacter crescentus Ion exchange chromatography/ammonium sulfate precipitation/gel filtration no ND 25 Table 1. FtsZ purification protocols described. ND: not determined. Sedimentation of FtsZ polymers Initially, we used two different velocities to spin down FtsZ polymers. We found that only at a velocity of 350,000 x g single polymers of FtsZEc are spun down (Figure 1) whereas at 190,000 x g only bundles of FtsZBs are present in the pellet fraction (data not shown). Therefore 350,000 x g was used in our further experiments. The percentage of polymerized FtsZEc and FtsZBs is similar at 50 mM KCl even though the light scattering experiments revealed a much higher scattering signal for FtsZBs. This is due to bundles formed by FtsZBs which scatter more light than single polymers of FtsZEc. It was not possible to obtain high amount of FtsZ polymers in the pellet fraction in the experiment with 300 mM KCl for both FtsZEc and FtsZBs (Figure 1). We attribute this to a combination of quick disassembly of the FtsZ structures and decreased bundling of the filaments. Sedimentation of FtsZ-SepF tubules To analyze the interaction of FtsZ with certain activators sedimentation assays can be performed at lower centrifugation speeds. At this velocity only large structures of FtsZ may be pelleted, e.g. the large tubules formed by SepF rings and FtsZBs filaments5, or the bundles formed by FtsZ and ZapA. We used lower centrifugation (24,600 x g) to demonstrate the feasibility of this approach for the tubules formed by FtsZ and SepF. FtsZ was recovered in the pellet above background levels only when both SepF and GTP were present in the sample (Figure 2), and the presence of SepF does not influence FtsZ GTPase activity7 showing that FtsZ is fully active in the presence of SepF. Specific sedimentation of SepF and FtsZ is roughly 45% of total SepF and 15% of total FtsZ (compared to material sedimenting when GDP is added). This shows that the SepF-FtsZ tubules contain more SepF than FtsZ. This may be because many SepF rings organize the FtsZ-SepF tubules5,7. The exact stoichiometry of SepF-FtsZ in these tubules is not known but our results suggest that there is more SepF present than FtsZ. FtsZEc and FtsZBs polymerization and bundling properties To characterize the polymerization efficiency of FtsZBs and FtsZEc in different buffers we analyzed both proteins by 90° angle light scattering. At 50 mM KCl, FtsZBs gives a 20-40-fold higher light scattering signal than FtsZEc depending on buffer pH (Figures 3A and B) confirming results of Buske et al.26 Increasing the KCl concentration in the buffer did not significantly influence the light scattering signal of FtsZEc (Figure 3D) but the signal of FtsZBs decreased ~80-fold at pH 7.5, ~30-fold at pH 6.8 and ~45-fold at pH 6.5 in 300 mM KCl (Figure 3C) compared to buffers with 50 mM KCl (Figure 3A). Disassembly of FtsZ polymers is faster at higher KCl concentration for both proteins (Figures 3C and D). Studies of Pacheco-Gómez et al. show that E. coli FtsZ polymerization and bundling is pH dependent. These authors found that in a buffer with 50 mM KCl the light scattering signal of FtsZ polymerization was higher, and disassembly of FtsZ took longer at pH 6.0 compared to pH 7.0 8. These results are not in agreement with our data from polymerization of FtsZEc at 50 mM KCl (Figure 3B), but it has to be noted that we have used three different buffers (HEPES, MES and PIPES) where Pacheco-Gómez et al. only used MES. Thus, not only the pH, but also buffer composition (ionic strength) affects the kinetics of FtsZ polymers at 50 mM KCl. However, at 300 mM KCl neither buffer composition nor pH influenced FtsZEc assembly in a detectable manner. A light scattering experiment of FtsZBs in buffers without KCl was not possible due to precipitation of the protein under these conditions. When the concentration of FtsZBs was lowered to 3 µM, precipitation did not occur. However, 3 µM is not the physiological concentration of FtsZ in the cell. In plastic cuvettes, FtsZBs did not precipitate at 12 µM at pH 7.5, but at pH 6.8 and 6.5 FtsZ still precipitated in the absence of KCl. Morphologies of FtsZ structures from E. coli and B. subtilis The structures formed by FtsZ were inspected by TEM. FtsZBs assembled into closely compacted polymers that covered the whole grid in all buffers at low salt (Figures 4A-C). FtsZEc formed long filaments, cables and bundles in all buffers at low salt (Figures 4D-F). However, the observable amount of polymers formed by FtsZEc was lower than the amount formed by FtsZBs. In high salt buffers FtsZBs formed longer single-stranded protofilaments which did not associate into bundles (Figures 4G-I). While FtsZBs protofilaments changed structure at higher salt concentration, FtsZEc formed structures indistinguishable from those of low salt buffer (Figures 4J-L). There was no observable pH influence on polymerization of FtsZEc but FtsZBs forms more bundles at pH 6.5 which are visible as closely compacted polymers and sheets (Figure 4B). These results are in accord with our light scattering experiments and previously published TEM work8,11,26. The GTPase activity of FtsZ at high and low KCl concentrations The GTP hydrolysis activity of FtsZ was measured under different conditions using a colorimetric assay for free phosphate. As reported previously15 the GTPase activity of FtsZ increased with increasing KCl concentration: depending on the buffer used FtsZBs. showed a 3-7 fold increase, and FtsZEc showed a 1.5-2.5 fold increase in GTPase activity at 300 mM KCl compared to 50 mM KCl. The reduced GTPase activity at 50 mM KCl is due to bundling of FtsZBs filaments. At 50 mM KCl FtsZEc had a 3-6 fold higher GTPase activity than FtsZBs due to quicker disassembly of the FtsZEc polymers. The difference in GTP hydrolysis activity between FtsZBs and FtsZEc was reduced at 300 mM KCl, possibly because of reduced bundling of FtsZBs filaments (Figure 5). Figure 1. Quantification of FtsZ polymerization by sedimentation. (A) 12 µM FtsZ was polymerized in the presence of 2 mM GTP or GDP at pH 7.5 (black bars), 6.8 (grey bars) or 6.5 (white bars). The amount of protein pelleted was determined by densitometric analysis of Coomassie stained gels. GDP served as a control for a specific sedimentation and the percentage of FtsZ sedimented with GDP was subtracted from the percentage of FtsZ sedimented with GTP to obtain the values plotted in the graph. On the left: FtsZ sedimented at 50 mM KCl, on the right: FtsZ sedimented at 300 mM KCl. (B) Representative results from Coomassie stained gels. Polymerization of FtsZBs (upper gel) and FtsZEc (lower gel) at 50 mM KCl. (S) supernatant, (P) pellet fractions from the experiment. Click here to view larger image. Figure 2. Sedimentation of SepF/FtsZ tubules at low speed. (A) 12 µM FtsZBs was polymerized with 2 mM GDP (white bars) or GTP (black bars). The amount of protein pelleted was determined by densitometric analysis of Coomassie stained gels. The + and – signs under the x-axis indicate the presence or absence of FtsZ and SepF in the reaction. (B) Representative results from a Coomassie stained gel. Polymerization of FtsZBs in the presence and absence of SepF. As a control SepF without FtsZ was used. Polymerization was carried out with GTP and GDP. (S) supernatant, (P) pellet fractions from the experiment. Click here to view larger image. Figure 3. Light scattering of 12 μM FtsZEc and 12 μM FtsZBs. FtsZs were assembled in the presence of 2 mM GTP and polymerization was monitored by 90° angle light scattering. Polymerization of FtsZBs (A) and FtsZEc (B) at 50 mM KCl at pH 7.5, pH 6.8, pH 6.5. Polymerization of FtsZBs (C) and FtsZEc (D) at 300 mM KCl at pH 7.5, pH 6.8 and pH 6.5. Click here to view larger image. Figure 4. Structures of FtsZBs and FtsZEc polymers visualized by electron microscopy. (A-L) Images of 12 µM FtsZBs (A-C and G-I) and FtsZEc (D-F) and (J-L) polymerized with 2 mM GTP. (A-C) FtsZBs in buffer with 50 mM KCl and pH 7.5, 6.8, and 6.5 respectively. (D-F) FtsZEc in buffer with 50 mM KCl and pH 7.5, 6.8, and 6.5 respectively. (G-I) FtsZBs in buffer with 300 mM KCl and pH 7.5, 6.8, and 6.5 respectively. (J-L) FtsZEc in buffer with 300 mM KCl and pH 7.5, 6.8, and 6.5 respectively. Scale bar: 100 nm. Click here to view larger image. Figure 5. GTP hydrolysis during FtsZ polymerization in 6 different buffers. In all experiments 2 mM GTP was used. As a control sample with no MgCl2 was used. Activity of FtsZ without MgCl2 was subtracted from the activity of FtsZ in the presence of MgCl2. On the left: GTPase activity of FtsZ at 50 mM KCl, on the right: GTPase activity of FtsZ at 300 mM KCl. Click here to view larger image.

Discussion

We describe a set of methods that allows a quick analysis of FtsZ activity and its interaction with other proteins. Light scattering, sedimentation and GTPase assays as well as electron microscopy have been widely used to study FtsZ polymerization. We have made some improvements to existing protocols, we showed the influence of different conditions on FtsZ assembly, and we propose controls that should be included in FtsZ studies.

We introduce low speed centrifugation to distinguish large structures formed by the association between FtsZ and its interacting proteins from FtsZ polymers. This method shows two advantages over the standard sedimentation assay. First, no background is formed by the FtsZ polymers in the pellet fraction as they are not spun down at 24,600 x g. Second, the amount of FtsZ present in the structure formed with an interacting protein may be calculated from the gel. Two critical steps in this method are the incubation time and the GTP concentration. It is important to centrifuge the large protein structure when it is complete but before it disassembles when all GTP is hydrolyzed. The best control for this study is polymerization of FtsZ with GDP. There is one potential limitation of the assay. FtsZ forms a stable complex with SepF, which can easily be spun down at 24,600 x g. If the sedimentation with another activator or a drug that bundles FtsZ polymers is performed, it may be necessary to adapt the assay. It may be done by changing the incubation time, or increasing the speed of centrifugation.

Proper preparation of the sample is the most important for light scattering experiments. Proteins must be precleared by spinning and all the buffers should be filtered prior to use. If any aggregates are present in the sample, they will disrupt a stable signal obtained from FtsZ polymers. For the analysis of the FtsZ structures by electron microscopy, preparation of a grid is the main step. The time of sample incubation on the grid will have the effect of producing more or less compacted polymers. For bundles of FtsZ_Bs, the time of incubation must be shorter than for FtsZ_Ec and FtsZ_Bs at high KCl concentration. We used a concentration of 12 µM for every sample to be able to compare the results. However, for FtsZ_Bs at 50 mM KCl a lower FtsZ concentration should be used, as 12 µM resulted in a full saturation of the grid. This makes the polymers highly compacted and difficult to detect. Less compacted polymers are better to detect on EM.

The GTPase assay is the only experiment used to study the activity rather than the structures of FtsZ. Mg²⁺ is necessary for GTP turnover in FtsZ polymers. Thus, in the absence of Mg²⁺, FtsZ does not hydrolyze GTP. Therefore, a sample with no Mg²⁺ is the right control in this assay but cations of Mg are present in the FtsZ storage buffer. They may be removed by addition of 1 mM EDTA to the control sample. The critical step in this assay is the incubation time. It is important to stop FtsZ activity after a given time. This is achieved by transferring the FtsZ sample to a malachite green solution in a 96-well plate. However, development of the malachite green color is a continuous process. Thus the measurements must be taken at the same time for every sample. Using a well-planned GTP addition protocol with measurements taken each 30 sec apart in an established order, it is possible to obtain the same incubation and sample handling time for every time point. Another critical step is choosing the concentration of the protein for the experiment. In the experiment we used two different concentrations for FtsZ_Ec and FtsZ_Bs. GTP hydrolysis is much quicker for FtsZ_Ec compared to FtsZ_Bs. The GTPase activity of FtsZ_Ec under chosen conditions and at 12 µM is linear only for maximum 5 min and after that time the hydrolysis rate plateaus. Thus, it is difficult to interpret data from the experiment when performed under these conditions. In this case FtsZEc must be used at lower concentration than FtsZ_Bs to be able to compare activities of both proteins. The GTPase activity of FtsZs from different sources may vary. Thus, the right concentration must be chosen. The concentration for FtsZ polymerization should be well above the critical concentration (in general from 2.5-10 µM). The dynamics of FtsZ assembly and disassembly is also important. Some proteins show a significant lag in polymerization after addition of GTP, as shown for FtsZBs at 50 mM KCl. It is useful to perform the light scattering assay before the GTPase assay to approximate the time of assembly and disassembly of FtsZ polymers. After that, the time of incubation and concentration of protein may be chosen. Since the conditions chosen for FtsZ polymerization are crucial, it is important to use the right pH and KCl concentration in each method. In this work we studied 9 different buffers with pH ranging from 6.5-7.5 and KCl concentrations from 0 M to 300 mM. We noticed that the best condition to analyze FtsZs from B. subtilis and E.coli and their biological activity is at pH that is close to physiological level (7.5) together with a high KCl concentration. At a high KCl concentration, FtsZ has a higher GTPase activity and produces polymers that are better detectable by electron microscopy. We also confirmed that the physiological pH and a high KCl concentration are better for the study of the interaction between FtsZ and regulatory proteins than any other buffers mostly used to study FtsZ assembly. FtsZBs shows a similar activity to FtsZEc when studied at high KCl concentration. In addition, at low salt concentration the influence of pH is more visible than in the buffers with high salt concentration. FtsZ sometimes precipitates when using buffers without KCl, as a result, buffers without salt should be avoided. Sedimentation of FtsZ polymers is low when using buffers with high KCl concentrations. This may be an advantage when studying interactions between FtsZ and proteins that assemble FtsZ filaments such as SepF and ZapA as these higher order structures are easy to detect with centrifugation. In all our experiments we used MgCl₂ at a 10 mM concentration. It was shown that a relatively high Mg²⁺ concentration stabilizes FtsZ polymers and reduces the GTPase activity of FtsZ. In Table 2 results from various studies are summarized describing FtsZ polymerization and GTPase activity at different Mg²⁺ concentrations using otherwise identical buffer conditions ²⁷. The measured concentration of free cytoplasmic Mg²⁺ is 0.9 mM³. It should be noticed that GTP will chelate an equivalent amount of Mg²⁺. Thus, the optimal Mg²⁺ concentration for GTPase experiments is around 2-2.5 mM, which is close to physiological level³. However, in our experiments we used MgCl₂ at a 10 mM concentration to obtain an easily detectable light scattering signal and to stabilize FtsZ polymers during the sedimentation assay.

Although we applied our protocols to FtsZ from the model organisms E. coli and B. subtilis, they can be adapted to FtsZ from any other organism. It has to be noted that the physiological pH, and concentrations of monovalent, and divalent cations differ among organisms. Thus, the optimal conditions for FtsZ polymerization may vary. Differences in doubling time and growth conditions of different bacteria may result in different assembly kinetics of FtsZ and optimal conditions of the experiments. However, our protocol provides a good starting point for the experiments with FtsZs from other organisms. The protocols should be useful for the study of FtsZ with regulatory proteins or the study of effects of small compounds and drugs on FtsZ.

Source	Polymerization [% of FtsZ sedimented]	GTPase [Pi/FtsZ/min]	Mg2+ concentration [mM]	FtsZ concentration [µM]	References
FtsZEc	~ 28%	~ 2.1	10	12	This work
	~ 50%	~ 2.4	10	12.5	27
	~ 43%	~ 3.5	5	12.5	27
	~ 27%	~ 4.6	2.5	12.5	27
	ND	~ 5.4	2.5	5	26
FtsZBs	~ 30%	~ 0.8		12	This work
	~ 52% (with DEAE dextran)	~ 0.5	10	10	11
	ND	~ 2.25	2.5	5	26

Table 2. Effect on Mg²⁺ on FtsZ polymerization and GTPase. Results from this work compared to published data. All experiments were carried out in 50 mM MES/ NaOH, pH=6.5, 50 mM KCl.

Materials

GTP	Roche	10106399001	Part 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
Thickwall Polycarbonate Tubes	Beckman Coulter	343776	Part 2
Optima MAX-XP Ultracentrifuge	Beckman Coulter	393315	Part 2, 3
Polyallomer Tube with Snap-on Cap	Beckman Coulter	357448	Part 3
AIDA Bio-package, 1D, 2D, FL	Raytest Isotopenmessgeräte GmbH	15000001	Part 4
Luminescence Image Analyzer LAS-4000	Fujifilm		Part 4
Thermo Spectronic AMINCO-Bowman Luminescence Spectrometer	Spectronic Instruments		Part 5
Fluorescence Cell	Hellma Analytics	105-250-15-40	Part 5
Square 400 Mesh, Copper, 100/vial	Electron Microscopy Sciences	G400-Cu	Part 6
CM120 Electron Microscope Operating at 120 kV	Philips		Part 6
96 ml x 0.2 ml Plate	BIOplastics	B70501	Part 7
Malachite Green Phosphate Assay Kit	BioAssay System	POMG-25H	Part 7
PowerWave HT Microplate Spectrophotometer	BioTek		Part 7