Kimyasal Dolayımlı Türler arası etkileşimleri tespit etmek Coculture kullanma
Summary
Bakteriler kendi mikrobiyal komşularının fizyolojisini etkileme potansiyeline sahip salgılanan bileşikler üretirler. Burada katı ortam üzerinde Bacillus subtilis flüoresan raportör transkripsiyon suşlar ile toprak mikrop karıştırılarak gibi kimyasal olarak aracılık edilen türler arası etkileşimlerin saptanmasına imkan veren bir kokültürü ekran tarif eder.
Abstract
Doğada, bakteriler nadiren izolasyon var, onlar yerine metabolitler salgılayarak yerel çevreyi değiştiren diğer mikroorganizmaların çeşitli bir dizi ile çevrilidir. Bu metabolitler kendi mikrobiyal komşularının fizyolojisini ve farklılaşmayı modüle potansiyeline sahip ve kurulması ve kompleks mikrobiyal toplulukların bakım muhtemel önemli faktörlerdir. Biz, kimyasal olarak aracılık edilen mikrobiyal etkileşimleri belirlemek için bir flüoresan bazlı kokültürü ekran geliştirdik. Ekran katı ortam üzerinde çevresel mikroplarla bir flüoresan raportör transkripsiyon gerginlik birleştiren ve ortak kültürü koloniler büyümeye izin gerektirir. Bu ilgi belirli bir fenotip ifade edildiğinde, seçilen bakteri suşu fluoresces böylece flüoresan raportör transkripsiyon tasarlanmıştır (yani biyofilm oluşumu, sporulasyon, hastalık oluşturma faktörü üretimi, vs.) Tarama büyüme koşulları altında gerçekleştirilir wheBu fenotip yeniden ifade (ve dolayısıyla haberci soy tipik nonfluorescent olan) değildir. Çevresel bir mikrop bu fenotip aktive eden bir metaboliti salgılar, bu agar boyunca yayılır ve flüoresan raportör konstruktunu aktive eder. Bu, indükleyici-metabolit üreten mikrop tespit edilmesini sağlar: bu floresan koloniler en yakın nonfluorescent koloniler bulunmaktadır. Bu nedenle, bu ekran, bir haberci soyuna özel bir fizyolojik tepkiyi harekete geçirilen bir yayılabilir metabolitleri üreten çevre mikropların belirlenmesini sağlar. Bu yayın için nasıl anlatılır: a) Uygun kokültürü tarama koşullarını seçmek, b) muhabiri ve tarama için çevresel mikropların hazırlamak, c) kokültürü ekranı gerçekleştirmek, d) varsayılan organizmaların uyaran izole, ve e) ikincil ekranda faaliyetlerini onaylayın. Biz Bacillus subtilis biyofilm matris üretimini aktive toprak organizmaları için ekran için bu yöntemi geliştirdi </em>, ancak, biz de diğer genetik uysal bakterilerin bu yaklaşımı uygulamak için konuları tartışmak.
Introduction
Biz bakterilerin salgıladığı metabolitler komşu mikropların fizyolojisini ve gelişimini nasıl etkilediğini anlamak ilgilendi. Birçok metabolitler diğer mikropların üzerindeki etkileri için biyolojik olarak aktif karakterize edilmiştir. İki iyi tarif edilen örnekler, diğer mikropların küresel gen ekspresyonunu değiştiren diğer mikropların büyümesini inhibe antibiyotikler, ve çoğunluk algılama molekülleri içerir. Bununla birlikte, bakteriler bilinen biyolojik aktiviteye 1 diğer birçok küçük molekül doğal ürünler üretmek. Biz bakteri gelişti ve onları en çok bakteri var, içinde kompleks mikrobiyal toplulukların kendi mikrobiyal komşularının hücresel fizyolojisini modüle izin çünkü bu metabolitlerin bazı üretmek için yeteneği korunmuş olması varsayımında.
Bacillus subtilis hücre tipleri
Biz bacil içeren kimyasal olarak aracılık mikrobiyal etkileşimleri konusunda çalışmalar yoğunlaşmıştırlus subtilis. Bu sadece, çünkü Gram-pozitif bakteri modeli ve manipülasyon için uygun edilen genetik araçlar olarak durumu, aynı zamanda, çünkü, özelliği hücre tiplerine ayırt kabiliyetini taşımaktadır. Örnekler hücreler bulunmaktadır:; sağlam biyofilm oluşumu için gerekli olan hücre dışı matrisi üretmek; çevre DNA almak için yetkin, yüzme ve diğer 2 arasında, sporlanan. Bu hücre tipleri, her biri onları, fizyolojik ve / veya fiziksel olarak ayrı bunların genetik olarak özdeş kardeşler yapan bir vasıftır, transkripsiyon regulon ifade eder. Birçok büyüme koşulları altında, birden fazla hücre tipi B. Tek bir koloni içerisinde gibi çeşitli alt-popülasyonunu arada subtilis hücreleri 3. Bakteri birçok türün benzer hücre tipi heterojen gösterebilirler, ancak, bu olgu özellikle de B. incelenmiştir subtilis.
EPD olan belirli genlerdeBu özel B. her biri içinde egulated subtilis hücre türleri tespit edilmiştir. Bu ilgi mikrobiyal fenotipleri çok doğrudan gözlemlemek zor veya imkansız olduğu için bu tür yukarı düzenlenen genlerin belirlenmesi burada açıklanan çalışma için gereklidir. Örneğin, görsel, böyle katı (% 1.5) ağar plakaları üzerinde yüzme gibi bir özellik tespit edemez bile B'nin ICSI'nin subtilis hücreleri bu koşullar altında 3 flagella'yı üretirler. Başka bir örnek biyofilm matris-üretimidir. Matriks üretimi (bu makroskopik kırışık koloniler ile sonuçlanır gibi) koloni morfolojisi ile görselleştirilmiştir, ancak bazı büyüme ortamında ve sadece büyüme 4 birden fazla gün sonra olabilir. Bununla birlikte, genlerin farklılaşması sırasında düzenlenen hangi bilerek, bu hücre tiplerinin içine hücresel farklılaşma belirteçleri olarak hareket kopyalayıcı gazetecilere inşa edebilirsiniz.
Raportör
Bu floresan transcriptional muhabir hücre tipi özel bir flüoresan protein genleri, örneğin, bir raportör genin üretimini tahrik etmek için promotörler içerir. Örnekler P x x gen için promotör bölge gösteren P (hücreler yüzme) YY-YFP, P Tapa-YFP (biyofilm matrisi üreten hücreler için) ve (sporlanan hücreler için) P-YFP SSPB içerir. Fenotip yerli düzenleme değişmeden kalır, böylece bu raportör kromozom üzerinde bir nötr lokusuna entegre (Şekil 1 ve aşağıya bakınız) vardır. Bir hücre bu fenotip ifade Ancak, şimdi, o da bir floresan proteini ifade eder. Bu bize, bu fizyolojik yanıtı aktive mikroplar taranması sağlayan, belirli fenotipik davranış aktivasyon kolayca görsel Okuması sağlar. Böyle gazetecilere yaygın mikrobiyoloji kullanılmasına rağmen, onlar geniş identif ekranları uygulanan edilmemiştirBu yöntemle önce mikroplar arasında y metabolik etkileşimler 5 nitelendirildi.
Hücre-tipi-spesifik haberci soylarının tasarımı ve kurulmasında önemli hususlar vardır. Yapıları diğer türleri kesinlikle mümkün olmasına rağmen biz sadece transkripsiyon floresan gazetecilere kullanmıştır. Biz iki nedenden dolayı, ancak, bizim ekranda hücre tipi farklılaşması için belirteç olarak öteleme füzyonların kullanımını vazgeçirmek: soğukkanlı yerel hücre türüne özgü protein ayrılmak 1) arzu, ve 2) tanıma bir diffüz, hücre- Geniş floresan (çeviri füzyonlarmı ile ortak) hücreler içinde lokalize puncta daha tespit etmek daha kolay olacaktır.
Muhabir gen seçimi
Bir okuma olarak transkripsiyon kullanmak için karar verdikten sonra, raportör geni (örneğin LacZ, floresan ya da lusiferaz) seçilmelidir. LacZ en özel ihtiyaç avantajına sahiptiralgılamak ekipman uluslararasılaûtırırken, ancak çevresel mikropların arasında yanlış pozitif çok daha yüksek bir ihtimal. Bizim ellerde, Lac toprak mikroplar arasında organizmaların + arka plan seviyesi (; veriler gösterilmemiştir toprak mikropların% 10 X-gal plakalar üzerine) Lac + (mavi idi >>) yasaklı yüksek oldu. Bu girişimi yoktu, ancak bu, ortam içinde X-gal konsantrasyonunu titre edilmesi ile, bu X-gal habercisinin kullanımına izin vermek için optimize edilmiş olması olasıdır. Lüsiferaz algılama için yüksek hassasiyet sağlar ve en dik muhabir: çevresel mikropların doğal ışıltılı olmanın neredeyse hiç şansı yoktur. Bununla birlikte, en çok oyuklu plakalar içerisinde sadece bölgesel bölgeleri taramak için tasarlanmış olduğu gibi zor, tüm Petri levhalar arasındaki ışıldama tespit izin bizim kurumunda aletleri tespit bulunmuştur. Ayrıca eşzamanlı fiziksel olan izin verilen bir şekilde ışıldayan koloniler görselleştirme komplikasyonlar olabilirneden olan organizmaların olation. Fiduciaries kullanarak bu mümkün yapmış olsa da, yerine B. çalışmak için kanıtlanmış olan floresan transkripsiyonel gazetecilere, kullanmak seçildi subtilis, algılama ve toprak organizmalar arasında düşük yanlış pozitif oranları yeterli duyarlılık sağlanan ve görselleştirme ve izolasyon prosedürleri hem de kolayca kullanılabilir enstrümantasyon kullanmak için izin.
Fluoroforun seçimi
Seçilen özel fluoroforun sizin bakteri türlerinin bağlıdır, kullandığınız agar büyüme ortamı ve özellikle floresan filtre kullanılabilir olması ayarlar. Bizim enstrümantasyon, bulduğumuz B. hem subtilis kendilerini ve YFP (sarı floresan protein) filtreler kullanıldığı zaman onlar bizim ellerde GFP (yeşil floresan protein) bu muhabir üstün yapım, daha az sergilediklerini eşiğe yetiştirilmiştir agar kolonilerinin. Floresan proteinler kodon kullanımı olanya da sık sık da bakteri türleri çalışmak için ya da bir kurucu promoter kullanılarak açık bir şekilde test etmek için, literatürde bilinen bir flüorofor seçmek için önemli hale ökaryotlar için optimize edilmiştir. Sürekli gelişen floresan protein varyantları sayıda kaynağa açıkça deney 9 için uygun bir floresan proteini seçiminde rehberlik bazıları 7,8, bir dizi gözden edildiği, 6 mevcut.
Yarışmayı seçimi
Bir promotörün seçimi büyük ölçüde bir hücre tipi ya da ilgi fenotipe bağlıdır. Örneğin B olarak organizmalar için subtilis, bir hücre tipi özel raportör genler, literatürde kurulmuştur. Diğer bakteriyel suşlar için, bir mikro ya da transkripsiyonel verileri temelinde yüksek koşullar altında yukarı regüle olan genler hakkında bilgi temin etmek için gerekli olacaktır burada ilgi i da hücre tipis tezahür. Yeni bir çalışma B. transkripsiyonunu Katalogda fayans mikrodizinleri 10 kullanarak 104 farklı büyüme koşulları altında subtilis. Bu kağıt genler son derece az-iyi-fenotip için çok değerli olan, farklı koşullar altında regüle edildiği hakkında kapsamlı bilgi sağlar.
Aksine ilgi her gen için promotör bölge kesin haritalama yerine, tipik olarak sadece promoter olarak, genin üst akışında 200-500 bp dizisi kullanır. Tam dizi uzunluğu genomik koşullara bağlıdır: Gerekli açık okuma çerçevelerini komşu yukarı kodlama bölgeleri de dahil olmak üzere önlemek için daha kısa zaman bölgeleri kullanılır.
Nötr loci ve entegrasyon
Da bakteri soyundaki haberci yapı, bir flüoresan raportör transkripsiyon gerilme tasarımı nihai soru olur korumak için. Bakterilerde, ilgi konusu genler sıklıkla korunurantibiyotik seçimi kullanarak plazmidler üzerinde. Bununla birlikte, çevresel mikrop öldürmeden ortak kültürü sırasında antibiyotik kullanmak mümkün olmayabilir. Plazmidler istikrarlı bir şekilde bakteri türlerinde muhafaza edilir, bu da bakteri taraması için raportör hazırlamak için antibiyotiklerin varlığında bir plazmid-kaynaklı reporter içeren büyümesi mümkündür ve daha sonra umuduyla kokültür kendisi sırasında antibiyotik ortadan kaldırabilir bu plasmid olacak yeterince floresan izin vermek için muhafaza edilebilir. Plazmidler kolayca bakteri içinde kaybolur, ya da stres şartları altında kaybolur, ancak bu uygun bir seçenek olmayacaktır. Birçok durumda, en iyi çözüm daha seçim yokluğunda muhabir kararlı bakımına olanak bakteriyel kromozomu üzerinde raportör yapıyı entegre olacaktır. Ilgi genin normal ifadesini veya düzenlemeyi bozmayacak entegrasyon açısından, biz kromozom üzerinde ektopik site içine entegre tavsiye ettiklerini can olarak hareket "nötr odağının." B. In subtilis bu entegrasyon siteler genler olduğunu – mutasyona uğradığı zaman – (entegranlarm antibiyotik seçimi olmadan tespit edilmesi sağlayan) belli minimal medyada bir fenotip iletmek, henüz zengin medya büyüme veya sporulasyon oranlarını değiştirmez, ve amyE, Laca gibi genlerini içerir, thrC, Pird, Glta ve saca (nişastayı kullanma yeteneği taşıma, β-galaktozitler, treonin, urasil, glutamat, ve sükroz, sırasıyla), 11-13.
Bu genlerin entegrasyon B'de yıllardır güvenilir kullanılmış olsa da subtilis (özellikle amyE Laca ve at), benzer bilgiler birçok diğer bakteri türlerinde genler için uygun olmayabilir. Faj bağlanma sitelerinin kullanımı nötr kromozom olarak entegrasyonu siteler için büyük alternatiflerdir: çok türe özel 14-16, hem de bu tür Tn7 birleşme bölgesi (att Tn7) gibi genel entegrasyon sitelerinbir çok bakteri türleri 17,18 tespit ve gen eklemeleri için kullanılmıştır.
Çevre mikroplar
Biz kokültürü ekran için çevresel mikropların doğrudan kaynağı olarak toprak kullanın. Toprak mikropların yüksek çeşitlilik içerir ve bu organizmaların bir çok doğal ürün zengin bir kaynağıdır. (Topraktan bakterilerin önceden izole edilmeden) fluoresan transkripsiyonel raportör türü ile plakalar üzerine yerleştirilir toprağın sıvı süspansiyonlar kullanarak, büyük ölçüde deneysel yaklaşım basitleştirir. Toprak ya da hemen sonra hasat kullanılabilir ya da gelecekte kullanılmak üzere -80 ° C de dondurulabilir. Hemen kullanımı sanayide iyi donma hayatta olmaz olanlar dahil olmak üzere, mikrop daha büyük bir çeşitlilik potansiyel olarak yetiştirilebilir avantajı vardır. Bu kullanılmalıdır ekran plakalarının sayısının artırılması, bu örneklerden ekilebilir toprak organizmaları konsantrasyonu bilinmeyen dezavantajına sahiptir. Delayed kullanımı koloni optimize edilmiş bir sayıda, her ekran plaka üzerinde büyümüş izin vererek, her bir toprak kaynağı için cfu / ml önceden belirlenebilir bir avantajı vardır. Ancak, toprak organizmaları dondurma kalan yeteneğine sahip olması gerekir.
Büyük filogenetik çeşitlilik olarak matris-indüksiyon ekranında tanımlanan isabet görülmemiştir: (toprak kaynaklarının yani) incelenmektedir indükleyici havuz çeşitlendirilmesi aynı topraklar üzerinde derinlemesine tarama daha yeni türler arası etkileşimler belirlenmesi daha etkili gibi görünmektedir unutmayın Ek toprak kaynakları daha ziyade iyice aynı toprak kaynakları (EA Shank ve R. Kolter, Harvard Tıp Fakültesi, yayınlanmamış sonuçlar) tarama daha incelendi.
Genel bakış
Biz burada açıklamak yaklaşımı, teknik gereklilikler açısından basittir. Bu içerir: 1) B'deki bir flüoresan raportör transkripsiyon yapımında subtilis ya da birdiğer ilgi bakteri türleri, 2), bu muhabir aktif değil hangi şartlar altında belirlenmesi 3) (bizim durumumuzda toprakta, ancak diğer kaynaklar yerine kullanılan olabilir) bu muhabir gerginlik ve taranması organizmaların alikolarını hazırlanması 4) Bu karıştırma Katı ortam, 5) tanımlanması ve varsayılan organizmaları uyaran izole, ve 6) bu organizmalar gerçekten ikincil ekranda bu fenotip aktive edersiniz teyit mikropların iki takım. Belirlendikten sonra, bu organizmalar ve bunların metabolitleri bakteri fizyolojisi ve mikrobiyal etkileşimleri çalışmak için, bakteriyel davranışı modüle etmek ve potansiyel gelecek terapötik bileşikler gibi yeni iskeleler hareket kimyasal araçları ile bize.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolün doğal sınırlamalar biri mikrobik organizmaların cultivability dayanıyor olmasıdır. De 24 belgelenmiştir gibi, gezegendeki en mikrobiyal yaşam (henüz) bugüne kadar araştırdı kültür koşullarında yetiştirilen olamaz. Böylece, doğal ortamlarında meydana gelen mikrobiyal türler arasındaki etkileşimleri çok sayıda bu yaklaşımı kullanarak tespit edilmeden gidecek. Arzumuz bu tür etkileşimlerin varlığını belirlemek, ama sonra da onlara aracılık eden mekanizmaları …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazar sayesinde, onun değerli tavsiye ve bu kokültürü ekranın geliştirilmesi sırasında yardım için Roberto Kolter (Harvard Medical School). O Şekil 6 elde yardım için de netlik için el yazması okuma teşekkür Matthew Powers, Chia-yi Cheng.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Spectrophotometer | Any spectrophotomer capable of measuing OD600 absorbance values. | ||
| Luria broth, Lennox | VWR | 80017-484 | Alternative media sources may be necessary. |
| Glass beads, 3 mm | VWR | 26396-508 | |
| Gel loading tips, round | VWR | 29442-666 | |
| Glass rods | VWR | 59060-069 | |
| Fluorescence dissecting stereoscope | Zeiss | N/A | The author used a Zeiss Stemi SV6 dissection stereoscope with an EXFO X-cite 120 fluorescent light source, a long-pass YFP filter cube, an achromat 0.63X objective, 10X eyepieces, and an Axio HRC HR digital camera. Most screening was done with the focusing mount at 2.0-3.2X. Any dissecting stereoscope with fluorescence capabilities is fine, provided you have the correct filters for the FP you are using. It is best if there is a shutter that allows you to easily switch between brightfield and fluorescense, as well as a stage that allows illumination from above and below. If you want to capture images, an attached camera is also necessary. |
References
- Berdy, J. Bioactive microbial metabolites. J. Antibiot. 58, 1-26 (2005).
- Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. Generation of multiple cell types in Bacillus subtilis. FEMS Microbiol. Rev. 33, 152-163 (2009).
- Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community. Genes Dev. 22, 945-953 (2008).
- Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. Fruiting body formation by Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11626 (2001).
- Shank, E. A., et al. Interspecies interactions that result in Bacillus subtilis forming biofilms are mediated mainly by members of its own genus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1236-1243 (2011).
- Piston, D. W., Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J., Claxton, N. S., Davidson, M. W. . Introduction to Fluorescent Proteins. , (2013).
- Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol. Rev. 90, 1103-1163 (2010).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. J. Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).
- Nicolas, P., et al. Condition-dependent transcriptome reveals high-level regulatory architecture in Bacillus subtilis. Science. 335, 1103-1106 (2012).
- Middleton, R., Hofmeister, A. New shuttle vectors for ectopic insertion of genes into Bacillus subtilis. Plasmid. 51, 238-245 (2004).
- Shimotsu, H., Henner, D. J. Construction of a single-copy integration vector and its use in analysis of regulation of the trp operon of Bacillus subtilis. Gene. 43, 85-94 (1986).
- Guerout-Fleury, A. M., Frandsen, N., Stragier, P. Plasmids for ectopic integration in Bacillus subtilis. Gene. 180, 57-61 (1996).
- Semsey, S., Blaha, B., Koles, K., Orosz, L., Papp, P. P. Site-specific integrative elements of rhizobiophage 16-3 can integrate into proline tRNA (CGG) genes in different bacterial genera. J. Bacteriol. 184, 177-182 (2002).
- Charpentier, E., et al. Novel cassette-based shuttle vector system for gram-positive bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 70, 6076-6085 (2004).
- Yang, H. Y., Kim, Y. W., Chang, H. I. Construction of an integration-proficient vector based on the site-specific recombination mechanism of enterococcal temperate phage phiFC1. J. Bacteriol. 184, 1859-1864 (2002).
- Choi, K. H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat. Protoc. 1, 153-161 (2006).
- Craig, N. L. Tn7: a target site-specific transposon. Mol. Microbiol. 5, 2569-2573 (1991).
- Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. J. Vis. Exp. (60), e3796 (2012).
- Lopez, D., Fischbach, M. A., Chu, F., Losick, R., Kolter, R. Structurally diverse natural products that cause potassium leakage trigger multicellularity in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 280-285 (2009).
- Vartoukian, S. R., Palmer, R. M., Wade, W. G. Strategies for culture of ‘unculturable’ bacteria. FEMS Microbiol. Lett. 309, 1-7 (2010).
- Romano, J. D., Kolter, R. Pseudomonas-Saccharomyces interactions: influence of fungal metabolism on bacterial physiology and survival. J. Bacteriol. 187, 940-948 (2005).
- Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix. Mol. Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).
- Zengler, K., et al. Cultivating the uncultured. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 15681-15686 (2002).
