Использование сокультивирования обнаружить химически опосредованной межвидовых взаимодействий

Summary

Бактерии производят секретируемых соединений, которые имеют потенциал, чтобы влиять на физиологию их микробных соседей. Здесь мы опишем экран сокультивирования, который позволяет обнаруживать таких химически опосредованных межвидовых взаимодействий, смешивая почвенных микробов с люминесцентными транскрипционных штаммов корреспондент Сенная палочка на твердых средах.

Abstract

В природе бактерии редко существуют изолированно, они вместо того, чтобы в окружении множества разнообразных других микроорганизмов, которые изменяют местную окружающую среду путем секреции метаболитов. Эти метаболиты имеют потенциал, чтобы модулировать физиологию и дифференциацию их микробных соседей и, вероятно, важными факторами в установлении и поддержании сложных микробных сообществ. Мы разработали экран сокультивирования флуоресценции основе для выявления таких химически опосредованных микробных взаимодействий. Экран включает объединение флуоресцентный транскрипции репортера напряжение экологических микробов на твердых средах и позволяет колонии расти в сокультивирования. Люминесцентная транскрипции репортер разработан таким образом, что выбранный бактериальный штамм флуоресцирует, когда он выражает особую фенотип интерес (т.е. формирование биопленки, споруляция, производства фактором вирулентности, и т.д..) Скрининг проводится в условиях роста Wheповторное этого фенотипа не выражена (и, следовательно репортер штамм обычно нефлуоресцентный). Когда окружающей микроб выделяет метаболит, который активирует этот фенотип, это диффундирует через агар и активирует флуоресцентного репортера конструкцию. Это позволяет индуцировать-метаболит продуцирующих микроб быть обнаружены: они являются наиболее нефлуоресцирующих колонии проксимальнее флуоресцентных колоний. Таким образом, этот экран позволяет идентифицировать экологических микроорганизмов, которые продуцируют к диффузии метаболитов, которые активируют определенный физиологический ответ у репортера штамма. Эта публикация обсуждает, как: а) выбрать соответствующие условия сокультивирования скрининга, б) подготовить репортеру и охраны окружающей среды микробов для скрининга, в) выполнять экран сокультивирования, г) изолировать предполагаемый вызывая организмов, и д) подтвердить свою деятельность в средней экране. Мы разработали этот метод для выявления почвенных организмов, которые активируют биопленки матрицу-производство в Сенная палочка </EM>, однако, мы также обсуждаем соображения для применения этого подхода к другим генетически послушными бактерий.

Introduction

Мы заинтересованы в понимании того, как метаболиты, что бактерии выделяют влияют на физиологию и развитие соседних микробов. Многие метаболиты были охарактеризованы для их биологически активных воздействий на других микробов. Два хорошо описанные примеры включают антибиотики, которые ингибируют рост других микробов, и молекулы кворума, которые изменяют глобальную экспрессию генов других микробов. Тем не менее, бактерии производят многие другие малые молекулы натуральные продукты, которые не имеют никаких известных биологической активности ^1. Мы предполагаем, что бактерии развивались и сохранили способность производить некоторые из этих метаболитов, потому что они позволяют им модулировать клеточную физиологию их микробных соседей в сложных микробных сообществ, которые существуют в пределах большинство бактерий.

Типы Сенная палочка клеток

Мы сосредоточили наши исследования по химически опосредованных микробных взаимодействий, которые включают BacilСЗП Сенная. Это не только из-за его статуса как грамположительных модели бактерии и полученные генетических инструментов, доступных для его манипуляции, но и из-за его способности дифференцироваться в характеризующихся типов клеток. Примеры включают в себя клетки, которые: бассейн; производящие внеклеточный матрикс, который необходим для формирования надежной биопленки; компетентные занять ДНК из окружающей среды, а также спорами, среди ^{прочего: 2.} Каждый из этих типов клеток выражает характерную транскрипции регулона, что делает их физиологически и / или физически отличны от их генетически идентичных элементов одного уровня. По многим условий роста, несколько типов клеток сосуществуют как различные субпопуляции в пределах одного колонии B. Сенная клетки ^3. Хотя многие виды бактерий могут проявлять аналогичную типа клеток неоднородность, это явление было особенно хорошо учился в B. Сенная.

В частности, генов, которые упрegulated внутри каждого из этих конкретных B. типы SUBTILIS клеток выявлено не было. Определение таких генов активируется имеет важное значение для работы, описанной здесь, потому что многие из этих микробных фенотипов интерес представляют трудно или невозможно наблюдать непосредственно. Например, мы не можем визуально обнаружить черта такие как плавание на твердых (1,5%) пластин агара, хотя субпопуляции B. Сенная клетки производят жгутики в этих условиях ^3. Другим примером является биопленки матрица-производство. Производство Матрица могут быть визуализированы морфологии колоний (как это приводит к макроскопически морщинистой колоний), но только на определенной среде для роста, и только после нескольких дней роста ^4. Однако, зная, какие гены активируется во время дифференцировки, можно построить транскрипции журналистам, которые действуют в качестве маркеров для клеточной дифференцировки в этих типах клеток.

Репортер конструкции

Это люминесцентные тranscriptional репортеры состоят из промоутеров для специфических генов камерного типа вождения производство геном-репортером, например флуоресцентный белок. Примеры включают P _HAG-YFP (для купания клетки), P _Тапа-YFP (для матричных-продуцирующие клетки биопленки) и Р _SSPB-YFP (для спорулирующим клетки), где Р _х указывает промоторную область для генной х. Эти репортер конструкции интегрированы в нейтральном локуса на хромосоме (фиг. 1 и см. ниже), так что родной регулирование фенотипа остается нетронутой. Однако теперь, когда клетка выражает эту фенотип, но и выражает флуоресцентный белок. Это обеспечивает легко визуализировать Считывание активации конкретного поведения фенотипической, что позволяет нам экран для микробов, которые активируют эту физиологическую реакцию. Хотя такие журналисты, как правило, используется в микробиологии, они не были широко применяется в экранах в IDENTIFу метаболические взаимодействия между микробами до этого метода была описана ^5.

Есть ряд важных соображений в проектировании и строительстве камерного типа конкретных штаммов репортеров. Мы использовали исключительно транскрипционные флуоресцентные журналистам, хотя другие виды конструкций, конечно, возможны. Мы не рекомендуем использовать трансляционных слияний в качестве маркеров для типа клеток дифференциации в нашем экране, однако, по двум причинам: 1) желание покинуть родной камерного типа конкретных белка невозмутимо и 2) признание того, что диффузное, клеточно- Широкий флуоресценции будет легче обнаружить, чем локализованной Puncta в клетках (общей с поступательным слияния).

Выбор ген Репортер

После принятия решения использовать транскрипцию как считывания, ген-репортер должен быть выбран (например, LacZ, флуоресценции или люциферазу). LacZ имеет то преимущество, нуждающихся мере специальныйIzed оборудование для обнаружения, но есть гораздо выше вероятность ложных срабатываний среди экологических микробов. В наших руках, фоновый уровень Lac ⁺ организмов среди почвенных микробов было непомерно высокой (>> 10% почвенных микробов были синие (Lac ⁺⁾ на Х-Gal пластин; данные не представлены). Вполне возможно, что путем титрования концентрации Х-Gal в среде, то это может быть оптимизирован, чтобы позволить использование Х-гал репортера, хотя мы не пытались это. Люциферазную обеспечивает высокую чувствительность обнаружения и является наиболее ортогональным репортер: почти нет шансов на экологические микробы по своей сути люминесцентные. Тем не менее, мы обнаружили, что трудно определить приборы в нашем учреждении, что позволило определять люминесценции через целых чашки Петри, а большинство из них были предназначены для сканирования только локализованные регионы в мульти-луночных планшетах. Там также может быть осложнения в визуализации люминесцентных колонии таким образом, чтобы также позволило одновременное Физическоеolation индуцировать организмов. При использовании доверенных лиц, возможно, сделали это возможным, мы вместо этого решили использовать люминесцентные транскрипционные журналистам, которые были доказаны, чтобы работать в B. зиЫШз, при условии, адекватную чувствительность обнаружения и низкой ложных срабатываний среди почвенных организмов, и разрешено использовать из легко доступного оборудования и для визуализации и процедурах изоляции.

Выбор флуорофора

Удельный флуорофором выбран будет зависеть от ваших видов бактерий, агар ростовую среду вы используете, и частности фильтр флуоресценции устанавливает у вас имеется. С нашей аппаратуры, мы обнаружили, что и Б. себя и агар они были выращены на выставлены меньше фоновой флуоресценции, когда были использованы YFP (желтый флуоресцентный белок) фильтры, что делает, что репортер превосходит GFP (зеленый флуоресцентный белок) в наших руках Сенная колонии. Использование кодонов флуоресцирующих белков являютсячасто оптимизированы для эукариот, поэтому важно, чтобы выбрать флуорофором либо известны из литературы для работы в ваших видов бактерий, или для проверки его явно с помощью конститутивный промотор. Большое количество постоянно меняющимися вариантов флуоресцентный белок в настоящее время доступны ^6, которые были рассмотрены в ряде источников ^7,8, некоторые из которых явно дать указания относительно выбора соответствующего флуоресцентный белок для вашего эксперимента ^9.

Выбор Промоутер

Выбор промотора во многом будет зависеть от вашего типа клеток или фенотипа интерес. Для организмов, таких как B. Сенная, некоторые конкретные гены-репортеры камерного типа были созданы в литературе. Для других бактериальных штаммов, рассматривая микрочипов или транскрипционные данные необходимо будет предоставить информацию о том, какие гены сильно активируется в условиях, когда ваш тип ячейки интересомс проявленная. Недавнее исследование в каталог транскрипцию B. Сенная под 104 различных условиях роста с использованием облицовочных микрочипов ^10. Эта статья предоставляет исчерпывающую информацию о том, какие гены сильно активируется при различных условиях, которые имеет неоценимое значение для менее хорошо охарактеризованных фенотипов.

Вместо отображения точных промоторные области для каждого интересующего гена, мы обычно просто использовать последовательность 200-500 п.н. выше гена в качестве промотора. Точная длина последовательности зависит от геномной контексте: короткие регионы используются, когда необходимо, чтобы избежать в том числе добывающих кодирующие области из соседних открытые рамки считывания.

Обычный локусов и интеграция

Как сохранить репортер конструкция в вашем бактериального штамма становится последний вопрос в проектировании флуоресцентный транскрипции репортера напряжение. У бактерий интересующих генов часто поддерживаетсяна плазмид с использованием выбор антибиотика. Тем не менее, это не всегда возможно использовать антибиотики в течение сокультивирования не убивая окружающей среды микробов. Если плазмиды стабильно поддерживается в своих бактериальных видов, это может быть возможным выращивать ваши бактерии, содержащие плазмиды-репортера иметь в присутствии антибиотиков, чтобы подготовить репортера для скрининга, а затем устранить антибиотики во время самой сокультивирования в надежде, что плазмида будет в достаточной степени поддерживается для обеспечения флуоресценции. Однако, если плазмиды легко теряются в бактерии или теряются в стрессовых условиях, это не будет жизнеспособным вариантом. Во многих случаях наилучшим решением будет интегрировать репортерной конструкцией на бактериальной хромосоме, которая позволяет стабильное поддержание репортера даже при отсутствии отбора. Для того, чтобы интеграция не нарушить нормальную экспрессию или регулирование вашего интересующего гена, мы рекомендуем интеграции в внематочной месте на хромосоме, что примернон выступать в качестве "нейтрального локуса." В B. Сенная эти интеграционные сайты гены, – когда мутировал – передать фенотип в определенной минимальной среде (с учетом интегранты быть определены без выбора антибиотиков), но не изменяют рост или цены споруляцию в мультимедиа, и включают в себя такие гены, как Amye, Laca, THRc, Pyrd, gltA, и SACA (транспортирующей возможность использовать крахмал, β-галактозиды, треонин, урацил, глутамат, и сахароза, соответственно) ^11-13.

В то время как интеграция в этих генов были надежно использоваться в течение многих лет в В. Сенная (особенно на Amye и Laca), похожи знания не могут быть доступны для генов во многих других видов бактерий. Использование фагов участков присоединения большие альтернативы для нейтральных хромосомных участков интеграции: многие видоспецифичность ^14-16, а также общие интеграционные сайты, такие как места прикрепления TN7 (ATT TN7) имеютбыли определены и использоваться для генных вставок во многих видов бактерий ^17,18.

Экологические микробы

Мы используем почву в качестве непосредственного источника экологических микробов для нашего экрана сокультивирования. Почва содержит большое разнообразие микробов, и многие из этих организмов богатый источник натуральных продуктов. С помощью жидких суспензий почвы, размещенные непосредственно на пластины с нашим флуоресцентного транскрипции репортера деформации (без предварительного выделения бактерий из почвы), мы значительно упростить экспериментальный подход. Почва может быть либо использованы сразу же после сбора урожая, или быть заморожены при -80 ° С для последующего использования. Немедленное использование имеет то преимущество, что большее разнообразие микробов потенциально можно выращивать, в том числе те, которые не выживут замораживания хорошо. Это имеет тот недостаток, что концентрация возделываемых почвенных организмов из этих образцов, неизвестно, увеличивая количество экранов пластин, которые должны быть использованы. ДельAyed использование имеет то преимущество, что КОЕ / мл для каждого источника почвы можно определить заранее, что позволяет оптимизированы количество колоний быть выращены на каждом экране пластины. Тем не менее, он требует, чтобы почва организмы способны выживать замерзания.

Обратите внимание, что диверсификация индуктора бассейн рассматривается (т.е. источников почвы), как представляется, более эффективны при выявлении новых межвидовые взаимодействия, чем углубленного скрининга на той же почве: больше филогенетическое разнообразие наблюдалось в хиты, выявленных в нашем экране матрица индукции как дополнительные источники почвы были рассмотрены, а не скрининга те же источники почвы более тщательно (Е.А. Shank и Р. Kolter, Гарвардской медицинской школы, неопубликованные результаты).

Обзор

Подход, который мы описываем здесь проста с точки зрения его технических требований. Она включает в себя: 1) построение флуоресцентный транскрипции репортера в B. Сенная илидругие виды бактерий из интереса, 2) определение условий, при которых этот репортер не активирован, 3) подготовка аликвоты этого репортера деформации и организмы могут быть экранированных (в нашем случае почвы, но и другие источники могут быть использованы вместо), 4) смешивание этих два комплекта микробов на твердых средах, 5) идентификации и выделения предполагаемый вызывая организмов, и 6), подтверждающий, что эти организмы действительно активировать эту фенотип в средней экране. После идентификации эти организмы и их метаболиты дают нам химических средств для модуляции бактериальной поведение, чтобы изучить бактериальной физиологии и микробных взаимодействий, а также выступать в качестве потенциально новых строительных лесов для будущих терапевтических соединений.

Protocol

1. Выберите гена-репортера и Построить Люминесцентная транскрипции Reporter Для В. зиЫШз: См. статью Юпитера в ссылки 19 для протокола, описывающего строительство люминесцентных транскрипционных репортеров в Сенная палочка. Для дру?…

Representative Results

Этот экран был использован для идентификации почвенных организмов секреции соединений, которые изменяют физиологию B. Сенная. Результаты, описанные здесь сосредоточиться на матрицы производящих типа клеток B. Сенная, который производит белок и экзополисахарид, которые необх…

Discussion

Одним из ограничений, присущих этому протоколу в том, что она опирается на cultivability микробных организмов. Как было хорошо документированы ^24, наиболее микробная жизнь на планете не может (пока) можно выращивать в условиях культивирования разведанных на сегодняшний день. Таким образ…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Spectrophotometer			Any spectrophotomer capable of measuing OD600 absorbance values.
Luria broth, Lennox	VWR	80017-484	Alternative media sources may be necessary.
Glass beads, 3 mm	VWR	26396-508
Gel loading tips, round	VWR	29442-666
Glass rods	VWR	59060-069
Fluorescence dissecting stereoscope	Zeiss	N/A	The author used a Zeiss Stemi SV6 dissection stereoscope with an EXFO X-cite 120 fluorescent light source, a long-pass YFP filter cube, an achromat 0.63X objective, 10X eyepieces, and an Axio HRC HR digital camera. Most screening was done with the focusing mount at 2.0-3.2X. Any dissecting stereoscope with fluorescence capabilities is fine, provided you have the correct filters for the FP you are using. It is best if there is a shutter that allows you to easily switch between brightfield and fluorescense, as well as a stage that allows illumination from above and below. If you want to capture images, an attached camera is also necessary.