采用共培养，以检测化学介导的种间相互作用

Summary

细菌产生有可能影响到他们的邻居微生物的生理潜力分泌的化合物。在这里，我们描述了一个共同培养屏幕，可以检测这些化学介导的种间相互作用的混合土壤中的微生物与固体培养基上枯草芽孢杆菌的荧光转录记者株。

Abstract

在自然界中，细菌很少孤立存在的，它们不是包围，从而改变当地环境通过分泌代谢物等微生物的多样化。这些代谢产物具有调节他们的邻居微生物的生理和分化的潜能，并在建立和维护复杂的微生物群落可能的重要因素。我们已经开发了一种基于荧光共培养筛选，以确定这些化学介导的微生物的相互作用。画面涉及结合荧光转录记者株在固体培养基上的微生物环境，并允许殖民地共培养成长。荧光转录记者被设计成使得当它被表达感兴趣的特定表型选择的细菌菌株发出荧光（ 即生物膜的形成，孢子形成，毒力因子的生产， 等等 ）被筛选生长的条件下进行的磨片再此表型是不表达的（并且因此报告菌株通常是无荧光）。当环境微生物分泌的代谢物激活此表型，它扩散通过琼脂并激活荧光报道构建体。这允许待检测的诱导代谢物生产的微生物：它们是无荧光的菌落最邻近的荧光菌落。因此，该屏幕允许产生的代谢物扩散激活在记者应变特定的生理响应环境微生物的鉴定。该出版物讨论如何：1）选择合适的共培养筛选条件，二）准备的记者和环境微生物的筛选，C）进行共培养屏，四）隔离推测诱导有机体，以及e）确认其在辅助屏幕活动。我们开发这个 ​​方法来筛选土壤生物激活生物膜基质生产的枯草芽孢杆菌 </em>的，但是，我们还讨论了考虑应用这种方法对其他基因听话细菌。

Introduction

我们感兴趣的是了解细菌分泌的代谢产物是如何影响相邻的微生物的生理和发育。许多代谢产物进行了表征他们对其他微生物的生物活性的影响。两个良好描述的实例包括抗生素，抑制其它微生物的生长，而群体感应分子，从而改变其它微生物的全基因表达。然而，细菌产生有没有已知的生物活性¹许多其他的小分子天然产品。我们推测，细菌已经进化和保存产生一些代谢产物的能力，因为他们让他们在调节范围内大多数细菌存在于复杂的微生物群落的微生物邻居的细胞生理学。

枯草芽孢杆菌的细胞类型

我们一直专注于研究，涉及Bacil化学介导的微生物的相互作用LUS芽孢杆菌。这不仅是因为其为革兰氏阳性菌的模型和用于它的操作所得到的遗传工具的状态，也由于其分化为特征的细胞类型的能力。例子包括细胞，分别是：游泳;生产所需要的强大的生物膜形成的细胞外基质，能吸收来自环境的DNA，并形成孢子，等等^2。每种类型的细胞表达的特性的转录调节子，使它们的生理和/或物理上不同的从他们的遗传上相同的同胞。根据许多生长条件下，多种细胞类型中B的单个菌落中共存的各种亚群枯草芽孢杆菌细胞^3。虽然许多种细菌可以表现出类似的细胞类型异质性，这种现象已被特别好地研究了B。枯草芽孢杆菌 。

尤其是，基因是不饱和聚酯树脂在每一个特定的B的egulated 枯草芽孢杆菌细胞类型已被确定。识别这样的上调基因是这里所描述的工作至关重要，因为许多这些利益微生物的表型是很难或不可能直接观察。例如，我们不能直观地检测出性状如固体（1.5％）琼脂平板上游泳，即使B的亚群枯草芽孢杆菌细胞产生这些条件³下鞭毛。另一个例子是生物膜基质生产。基质的产生可以通过菌落形态可视化（因为它导致宏观皱殖民地），但仅限于特定的生长培养基，只有经过增长⁴多天。然而，通过了解哪些基因分化过程中被上调，我们可以构建转录记者，作为标记物的细胞分化成这些类型的细胞。

记者构造

这些荧光吨ranscriptional记者组成的启动子对细胞类型特异性基因驱动的生产报告基因，例如一个荧光蛋白。实例包括对_HAG-YFP（游泳细胞），P _TAPA-YFP（生物膜基质产生细胞）和P _SSPB-YFP（对于形成孢子的细胞），其中，P _x表示的启动子区域进行X基因。这些报道构建整合到染色体上的中立位点（ 图1和见下文），从而使表型的天然调节保持不变。但是，现在，当一个细胞表达这种表型，它也表现为一种荧光蛋白。这提供了一个可视化容易读出的特定表型行为的活化，使我们能够筛选的微生物，激活这个生理反应。虽然这样的记者，在微生物学通常被使用，它们没有被广泛地在屏幕上以便识别适用此方法之前微生物之间Ÿ代谢相互作用被描述^5。

有许多的细胞类型特异性记者菌株的设计和施工的重要考虑因素。我们已经利用专门的转录荧光记者，虽然其他类型的结构是可能的。我们不鼓励使用翻译融合作为标记物在我们的屏幕细胞类型的分化，但是，有两个原因：1）离开原生细胞类型特异性蛋白沉着的欲望，和2）认识到弥漫，细胞广泛的荧光会更容易发现比细胞内的局部泪点（常见的翻译融合）。

报告基因的选择

在决定使用转录为读出后，将报告基因，必须选择（ 如 LacZ基因，荧光，或荧光素酶）。 LacZ的有需要的至少是特殊的优势美化版设备来检测，但有假阳性微生物的环境中高得多的可能性。在我们的手中，紫胶⁺生物土壤中的微生物本底水平是高的惊人（>>土壤微生物的10％是蓝色的（紫胶^+）对X-gal的平板;数据未显示）。这可能是通过滴定培养基中的X-gal的浓度，这可被优化以允许使用的X-gal的记者，尽管我们并没有试图这样。荧光素酶提供检测灵敏度高，是最正交记者：几乎没有任何机会的环境是微生物本身发光。然而，我们发现它很难识别仪器在我们的机构，允许发光检测在整个培养皿，因为大多数被设计为仅扫描局部区域的多孔板。也可能存在于可视化发光殖民地的方式，也让同步物理是并发症olation诱导有机体。当使用受信人可能有这样的可能，我们反而选择使用荧光转录记者，这是在证明B.工作枯草芽孢杆菌 ，提供了检测和土壤生物体中低假阳性率的足够的灵敏度，并允许使用容易获得的仪器为可视化和分离步骤。

荧光基团的选择

所选的特定荧光团将取决于你的细菌种类，您所使用的琼脂培养基，和特定的荧光滤镜设置您有可用。随着我国仪器仪表中，我们发现，无论是B。枯草芽孢杆菌菌落自己和他们生长在展出较少的背景荧光，当被用于YFP（黄色荧光蛋白）过滤器，使得在我们手中了记者优于GFP（绿色荧光蛋白）的琼脂。荧光蛋白的密码子使用的是经常用于真核生物的优化，因此有必要选择荧光团从文献中已知的任一中的细菌物种的工作，或者使用组成型启动子明确地对其进行测试。是大量的不断变化的荧光蛋白变种现有^6，已在多个源^7,8，其中一些对实验⁹选择合适的荧光蛋白质明确地提供指导审阅。

启动子的选择

一个启动子的选择将在很大程度上取决于你的细胞类型或感兴趣的表型。对于生物体，如B。枯草芽孢杆菌 ，某些细胞类型特异性的报告基因已经建立在文献中。对于其他细菌菌株，研究微阵列或转录的数据将需要提供哪些基因的条件下是高度上调的信息，其中的利益，我的细胞类型s的体现。最近的一项研究编目B的转录根据使用平铺芯片¹⁰ 104不同的生长条件芽孢杆菌 。本文提供全面的信息基因在不同条件下高度上调哪些，这是非常宝贵的不太充分表征的表型。

而不是绘制精确的启动子区域的每个感兴趣的基因，我们通常只需使用序列200-500 bp的基因的启动子上游。确切的序列长度依赖于基因组的上下文：较短的区域被使用时，必须避免包括上游编码区从邻近的开放阅读框。

中性位点和整合

如何保持你的细菌菌株记者构造成为设计的荧光转录报告菌株的最后一个问题。在细菌中，目的基因经常保持在使用抗生素的选择质粒。然而，它可能无法共存期间使用抗生素而不杀死的微生物环境。如果质粒稳定地保持在你的细菌种类，它可能会成长含有质粒携带的记者在抗生素存在的细菌以制备的记者进行筛选，然后在共存本身中消除抗生素，希望该质粒将被充分地维持，以允许荧光。然而，如果质粒容易丢失更多的细菌，或胁迫条件下会丢失，这不会是一个可行的选择。在许多情况下，最好的解决方法是将本报道构建整合到细菌染色体上，允许稳定地维持记者的即使在没有选择的。为了使整合不会破坏你感兴趣的基因的正常表达调控，我们建议在染色体上的整合到一个网站异位该CAÑ​​充当“中性位点。” B.中枯草这些整合位点是基因-突变时-表达的表型在某些基本培养基（允许不用抗生素的选择应确定整合体），但不改变在富媒体的增长或产孢率，并且包括这些基因作为AMYE，LACA，的thrC，pyrD，的gltA，和萨卡 （输送到利用淀粉的能力，β-半乳糖苷，苏氨酸，尿嘧啶，谷氨酸盐，蔗糖，分别^）11-13。

而整合这些基因得到了可靠的使用多年的B。枯草芽孢杆菌 （尤其是在的AmyE和LACA），类似知识可能不提供对基因在许多其他细菌物种。利用噬菌体附着位点是中性染色体整合位点伟大的替代品：许多物种特异性^14-16，以及一般的整合位点，如Tn7转附着部位（ATT Tn7转）有已经确定，并用于基因插入在许多种细菌^17,18。

环境微生物

我们利用土壤作为环境微生物为我们的共同培养​​屏幕的直接来源。土壤中含有微生物的高度多样性，许多这些生物是天然产物来源丰富。通过使用土壤的液体悬浮液直接置于板与我们的荧光转录报告菌株（不含从土壤细菌事先隔离），我们大大简化了实验方法。土可以被用来收割后立即，或者在-80℃下以供将来使用被冻结。立即使用具有微生物的更大的多样性可能会被种植的优势，包括那些将无法生存冻结很好。它的缺点是可耕土壤生物体从这些样品中的浓度是未知的，增加了必须使用屏板的数目。德尔AYED使用具有的优点是对菌落形成单位/毫升的各土壤源可以预先确定，从而允许在每个屏板将要生长的菌落的一个优化的数目。然而，它需要的土壤生物能力经受冻结。

需要注意的是多元化宗正（ 即土壤源）诱导池似乎是更有效地识别较深入的筛查在同一土壤中的新物种间的相互作用：更大的系统发育多样性，观察在我们的基质诱导屏确定为命中额外的土壤源进行了检查，而不是筛选同一土壤源更彻底（EA柄和R. Kolter声称，哈佛医学院，未公布结果）。

概观

我们在这里描述的方法是直接在其技术要求方面。它包括：1）构建荧光转录记者在B。枯草芽孢杆菌或其他感兴趣的细菌菌种来说，2）识别条件下与记者没有被激活，3）制备本报告菌株和生物体被筛选的等份（在我们的情况下的土壤，但是其它来源可以被用来代替），4）将这些两组在固体培养基上，5）鉴定和分离推定的诱导有机体，和6），确认​​这些生物体确实激活这种表型在二级屏幕的微生物。一旦确定，这些微生物及其代谢产物为我们提供化学工具来调节细菌行为，研究细菌的生理和微生物的相互作用，并有可能作为新型支架的未来治疗性化合物。

Protocol

1。选择一个报告基因，并构建一个荧光转录记者 对于枯草芽孢杆菌： 见参考图19描述的荧光转录记者在枯草芽孢杆菌建设协议的朱庇特的文章。 对于其他细菌物种： 确定是在感兴趣的生理反应上调的基因。这可以是基于现有的文献中或特定条件下，微生物的转录分析。 构建荧光转录记者这个基?…

Representative Results

这个屏幕被用来确定土壤生物体分泌，从而改变B的生理学化合物枯草芽孢杆菌 。此处描述的结果集中在B的基质产生细胞类型枯草芽孢杆菌 ，其产生所必需的强大的生物膜形成这种细菌的蛋白和胞外多糖。我们选择了TAPA-sipW-TASA操纵子的启动子为我们的荧光报告基因构建体（P TAPA-YFP）。此操纵子编码矩阵的蛋白质结构部件和生物膜基质生产23</s…

Discussion

其中本协议的固有的局限性在于，它依赖于微生物有机体的培养力。由于已经有据可查^24，大多数微生物的生命在这个星球上不能（还）进行探讨，以当日的培养条件下生长。因此，一个巨大的正在发生在自然环境中的微生物物种之间的相互作用的数量会使用这种方法去未被发现。然而，由于我们的愿望是，不仅确定这种相互作用的存在，但后来也学习参与调解他们的机制和分子，培养这…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Spectrophotometer			Any spectrophotomer capable of measuing OD600 absorbance values.
Luria broth, Lennox	VWR	80017-484	Alternative media sources may be necessary.
Glass beads, 3 mm	VWR	26396-508
Gel loading tips, round	VWR	29442-666
Glass rods	VWR	59060-069
Fluorescence dissecting stereoscope	Zeiss	N/A	The author used a Zeiss Stemi SV6 dissection stereoscope with an EXFO X-cite 120 fluorescent light source, a long-pass YFP filter cube, an achromat 0.63X objective, 10X eyepieces, and an Axio HRC HR digital camera. Most screening was done with the focusing mount at 2.0-3.2X. Any dissecting stereoscope with fluorescence capabilities is fine, provided you have the correct filters for the FP you are using. It is best if there is a shutter that allows you to easily switch between brightfield and fluorescense, as well as a stage that allows illumination from above and below. If you want to capture images, an attached camera is also necessary.