Bruke coculture å oppdage Kjemisk mediert uspesifikt Interaksjoner

Summary

Bakterier produserer utskilling av stoffer som har potensial til å påvirke fysiologi av sine mikrobielle naboer. Her beskriver vi en coculture skjerm som tillater påvisning av slike kjemisk medierte uspesifikt interaksjon ved å blande jord mikrober med fluorescerende transkripsjons reporter stammer av Bacillus subtilis på faste medier.

Abstract

I naturen, bakterier finnes sjelden i isolasjon, de er i stedet omgitt av et variert utvalg av andre mikroorganismer som endrer det lokale miljøet ved å skille metabolitter. Disse metabolittene har potensial til å modulere fysiologi og differensiering av sine mikrobielle naboer og er trolig viktige faktorer i etablering og vedlikehold av komplekse mikrobielle samfunn. Vi har utviklet en fluorescens-basert coculture skjermen for å identifisere slike kjemisk medierte mikrobielle interaksjoner. Skjermen innebærer å kombinere et fluorescerende transcriptional reporter belastningen med miljø mikrober på faste medier og tillater koloniene å vokse i coculture. Den fluorescerende transcriptional reporter er utformet slik at den valgte bakteriestammen fluorescerer når den uttrykker en spesiell fenotype av interesse (dvs. biofilmdannelse, sporulering, virulens faktor produksjon, etc.) Screening utføres under vekstbetingelser where denne fenotype er ikke uttrykt (og derfor reporteren belastningen er typisk nonfluorescent). Når en miljø mikrobe utskiller en metabolitt som aktiverer denne fenotype, diffunderer det gjennom agar og aktiverer den fluorescerende reporter konstruere. Dette gjør det mulig å fremkalle-metabolitten produserende mikrobe som skal påvises: de er nonfluorescent kolonier mest proksimale til de fluorescerende kolonier. Således tillater denne skjermen identifisering av miljømessige mikrober som produserer diffunderbare metabolitter som aktiverer en spesiell fysiologisk respons i en reporter belastning. Denne publikasjonen drøfter hvordan du: a) velge passende coculture screening forhold, b) utarbeide reporteren og miljø mikrober for screening, c) utføre coculture skjermen, d) isolere antatte induserende organismer, og e) bekrefter sin aktivitet i en sekundær skjerm. Vi utviklet denne metoden for å screene for jordorganismer som aktiverer biofilm matrise-produksjon i Bacillus subtilis

Introduction

Vi er interessert i å forstå hvordan de metabolitter som bakteriene skiller påvirker fysiologi og utvikling av nabo mikrober. Mange metabolitter er blitt karakterisert for deres bioaktive virkninger på andre mikrober. To godt beskrevne eksempler omfatter antibiotika som hemmer veksten av andre mikroorganismer, og quorumsmed føler molekyler, som endrer den globale genekspresjon av andre mikrober. Men bakterier produserer mange andre små molekyl naturlige produkter som ikke har noen kjente bioaktivitet ^en. Vi hypotese at bakterier har utviklet seg og bevart evnen til å produsere noen av disse metabolittene, fordi de tillater dem å modulere cellulær fysiologi deres mikrobielle naboer i de komplekse mikrobielle samfunn innenfor hvilke de fleste bakterier eksisterer.

Bacillus subtilis celletyper

Vi har fokusert våre studier på kjemisk medierte mikrobielle interaksjoner som involverer Bacillus subtilis. Dette er ikke bare på grunn av sin status som Gram-positive bakterie-modellen, og de resulterende genetiske verktøy for sin manipulasjon, men også på grunn av dens evne til å differensiere til karakteriseres celletyper. Eksempler inkluderer celler som er: Svømme; produserende den ekstracellulære matrise som kreves for robust biofilmdannelse; kompetente til å ta opp DNA fra omgivelsene, og sporulating, blant andre ^to. Hver av disse celletyper uttrykker et karakteristisk transcriptional regulon som gjør dem fysiologisk og / eller fysisk adskilt fra sine genetisk identiske søsken. Under mange vekstvilkår, flere celletyper eksistere som ulike subpopulasjoner innenfor en enkelt koloni av B. subtilis celler ^tre. Selv om mange arter av bakterier kan utvise analogt celletype heterogenitet, dette fenomenet har blitt spesielt godt studert i B. subtilis.

Særlig gener som er UPRegulated innenfor hver av disse spesifikke B. subtilis celle-typer er identifisert. Identifisere slike oppregulert gener er viktig for det arbeidet som er beskrevet her, fordi mange av disse mikrobielle fenotyper av interesse er vanskelig eller umulig å observere direkte. For eksempel kan vi ikke visuelt oppdage en egenskap som svømming på solid (1,5%) agar plater, selv om en undergruppe B. subtilis cellene produserer flag under disse betingelsene ^tre. Et annet eksempel er biofilm matrise-produksjon. Matrix produksjonen kan visualiseres ved koloni-morfologi (som det resulterer i makroskopisk wrinkly kolonier), men bare på visse vekstmedium, og først etter flere dager med vekst ^4.. Men ved å vite hvilke gener som er oppregulert i løpet differensiering, kan vi konstruere transkripsjons journalister som fungerer som markører for cellulær differensiering i disse celletypene.

Reporter konstruerer

Disse fluorescerende transcriptional reportere består av de promotorer for celletypespesifikke gener som styrer produksjonen av et reporter-genet, for eksempel en fluorescerende protein. Eksempler inkluderer P _kjerring-YFP (for svømming celler), P _tapa-YFP (for biofilm matrix-produserende celler), og P _sspB-YFP (for sporulating celler), hvor P _x indikerer promoter regionen for gen x. Disse rapportørinnretninger integrert i en nøytral locus på kromosom (figur 1 og se nedenfor), slik at den opprinnelige regulering av fenotypen er intakt. Men, nå når en celle uttrykker dette fenotype, også uttrykker det et fluorescerende protein. Dette gir en lett visualiseres lese ut av aktivering av spesielle fenotypiske atferd, slik at vi kan screene for mikrober som aktiverer dette fysiologisk respons. Selv om slike journalister blir ofte brukt i mikrobiologi, de har ikke blitt bredt anvendt i skjermer til identify metabolske interaksjoner mellom mikrober før denne metoden ble beskrevet ^fem.

Det finnes en rekke viktige hensyn ved utforming og konstruksjon av celle-type-spesifikk rapportør stammer. Vi har benyttet utelukkende transkripsjons fluorescerende reportere, selv om andre typer konstruksjoner er absolutt mulig. Vi fraråder bruken av translasjonelle fusjoner som markører for celletypen differensiering i vårt skjermen, men av to grunner: 1) et ønske om å forlate den opprinnelige celle-type-spesifikk protein uaffisert, og 2) den anerkjennelse at en diffus, celle- bredt fluorescens vil være lettere å oppdage enn lokaliserte puncta i cellene (felles med translasjonell fusjoner).

Reporter genet utvalg

Etter beslutter å bruke transkripsjon som en avlesning, må reporteren genet velges (f.eks LacZ, fluorescens, eller luciferase). LacZ har fordelen av å måtte det minste spesiellesert utstyr for å oppdage, men det er en mye høyere sannsynlighet for falske positiver blant miljø mikrober. I våre hender, bakgrunnsnivået av Lac ⁺ organismer blant jord mikrober var uoverkommelig høy (>> 10% av jord mikrober var blå (Lac ⁺⁾ på X-gal-plater, data ikke vist). Det er mulig at ved å titrere konsentrasjonen av X-gal i mediet, kan dette være optimalisert for å tillate bruk av en X-gal reporter, selv om vi ikke forsøker dette. Luciferase gir høy følsomhet for deteksjon og er den mest ortogonale reporter: det er nesten ingen sjanse for miljø mikrober å være iboende selvlysende. Men vi fant det vanskelig å identifisere instrumentering ved vår institusjon som tillot luminescens deteksjon over hele Petri plater, som de fleste var laget for å skanne bare lokaliserte regioner i multi-brønn plater. Det kan også være komplikasjoner i å visualisere selvlysende kolonier på en måte som også tillot samtidig fysisk erolation av induserende organismer. Mens du bruker forvaltere kan ha gjort dette mulig, vi i stedet valgt å bruke fluorescerende transkripsjons journalister, som ble vist seg å fungere i B. subtilis, forutsatt tilstrekkelig følsomhet for deteksjon og lave falske positiver blant jordorganismer, og lov til å bruke av lett tilgjengelig instrumentering for både visualisering og isolasjonsprosedyrer.

Fluoroforen utvalg

Den spesifikke fluoroforen velges vil avhenge av dine bakteriearter, agar vekstmedium du bruker, og den spesielle fluorescens filter setter du har tilgjengelig. Med vår instrumentering, fant vi at både B. subtilis kolonier seg selv og agar de ble dyrket på utstilt mindre bakgrunnsfluoresens når YFP (gul fluoriserende protein) filtre ble brukt, noe som gjør at reporter overlegen til GFP (grønt fluorescerende protein) i våre hender. Den kodonanvendelse av fluorescerende proteiner erofte optimalisert for eukaryoter, noe som gjør det viktig å velge en fluorofor enten kjent fra litteraturen å arbeide i bakteriearter, eller å teste det eksplisitt ved hjelp av en konstitutiv promoter. Et stort antall av stadig nye fluorescerende protein varianter er for tiden tilgjengelig ^6, som har blitt anmeldt i en rekke kilder ^7,8, hvorav noen eksplisitt gi veiledning om hvordan du velger en passende fluorescerende protein for eksperimentet ^ni.

Arrangøren utvalg

Valget av en promoter vil i stor grad avhenge av celletype eller fenotype av interesse. For organismer som B. subtilis, enkelte celle-type spesifikke rapportørgener er blitt etablert i litteraturen. For andre bakteriestammer, vil undersøke microarray eller transcriptional data være nødvendig å gi informasjon om hvilke gener som er sterkt oppregulert under forhold der mobil type interesse is manifestert. En fersk studie katalogisert transkripsjon av B. subtilis henhold 104 forskjellige vekstforhold ved hjelp flislegging mikromatriser ^10. Dette papiret gir omfattende informasjon om hvilke gener som er sterkt oppregulert under ulike forhold, noe som er uvurderlig for mindre godt karakterisert fenotyper.

I stedet for å kartlegge nøyaktige promoter regioner for hvert gen av interesse, vi vanligvis bare bruke sekvensen 200-500 bp oppstrøms for genet som promotoren. Den eksakte sekvens lengde avhenger av genomisk kontekst: kortere regioner brukes når det er nødvendig for å unngå å inkludere oppstrøms koding regioner fra nabo åpne leserammer.

Nøytral loci og integrering

Hvordan å opprettholde reporter konstruere i din bakteriestammen blir det siste spørsmålet i utformingen av en fluorescerende transcriptional reporter belastning. I bakterier, er gener som er av interesse ofte opprettholdtpå plasmider ved hjelp av antibiotika utvalg. Imidlertid kan det ikke være mulig å bruke antibiotika under coculture uten å drepe de miljømessige mikrober. Hvis plasmider blir stabilt opprettholdt i de bakterielle arter, kan det være mulig vokse bakterier inneholdende et plasmid-båret reporter i nærvær av antibiotika for å klargjøre reporter for screening, og deretter eliminere antibiotika i løpet av coculture seg i det håp at plasmidet skal i tilstrekkelig grad kan opprettholdes for å tillate for fluorescens. Men hvis plasmider er lett tapt i bakterien, eller går tapt under stress forhold, vil dette ikke være et levedyktig alternativ. I mange tilfeller vil den beste løsningen være å integrere reporter konstruksjon på bakterielt kromosom, som tillater stabil opprettholdelse av reporteren selv i fravær av seleksjons. For at integrasjonen skal ikke forstyrre den normal uttrykk eller regulering av genet av interesse, anbefaler vi å integrere inn i en ektopisk område på kromosomet som can fungere som en "nøytral locus." I B. subtilis disse integrasjons nettsteder er gener som - når mutert - formidle en fenotype i visse minimal medier (slik integranter å bli identifisert uten antibiotika utvalg), men likevel ikke endre vekst eller sporulation priser i rike medier, og omfatter slike gener som Amye, LACA, thrC, pyrD, gltA og SACA (formidle evnen til å utnytte stivelse, β-galactosides, treonin, uracil, glutamat og sakkarose, henholdsvis ^11-13).

Mens integrering i disse gener har blitt brukt på en pålitelig måte i mange år i B. subtilis (spesielt i Amye og LACA), kan tilsvarende kunnskaper ikke være tilgjengelig for gener i mange andre bakteriearter. Bruken av fag vedlegg nettsteder er gode alternativer for nøytrale kromosomintegrasjonssider: mange artsspesifikk ^14-16, samt generelle integrerings steder som TN7 festestedet (att TN7) harDet er oppdaget og utnyttet for genet innsettinger i mange bakteriearter ^17,18.

Miljø mikrober

Vi bruker jord som en direkte kilde til miljø mikrober for vår coculture skjermen. Den jord inneholder store mangfoldet av mikroorganismer, og mange av disse organismer er rik kilde av naturlige produkter. Ved å bruke flytende suspensjoner av jord plasseres direkte på tallerkener med vår fluorescerende transcriptional reporter belastning (uten isolering av bakterier fra jord), vi forenkler eksperimentell tilnærming. Jordsmonnet kan enten brukes umiddelbart etter innhøsting, eller fryses ved -80 ° C for fremtidig bruk. Umiddelbar bruk har den fordelen at et større mangfold av mikrober kan potensielt bli dyrket, inkludert de som ikke vil overleve frysing godt. Det har den ulempe at konsentrasjonen av dyrkbar jord organismer fra disse prøvene er ukjent, noe som øker antall skjermplater som skal benyttes. DelAyed bruk har den fordel at de cfu / ml for hver jordkilde kan bestemmes på forhånd, slik at et optimalt antall kolonier dyrkes på hvert skjerm-plate. Men, det krever at jordorganismer være i stand til å overleve frysing.

Merk at diversifisere indus bassenget blir undersøkt (dvs. jord kilder) ser ut til å være mer effektiv på å identifisere nye uspesifikt interaksjoner enn grundig screening på samme jord: større fylogenetisk mangfold ble observert i de treff identifisert i vår matrise-induksjon skjermen som ekstra jord kilder ble undersøkt i stedet for screening samme jord kilder mer grundig (EA Shank og R. Kolter, Harvard Medical School, upubliserte resultater).

Oversikt

Tilnærmingen vi beskriver her er grei i form av dens tekniske krav. Det innebærer: 1) å konstruere et fluorescerende transcriptional reporter i B. subtilis, eller enandre bakterielle arter av interesse, 2) å identifisere betingelser under hvilke denne reporter ikke er aktivert, 3) fremstilling av alikvoter av denne reporter belastning og organismer som skal screenes (i vårt tilfelle jord, men også andre kilder kan benyttes i stedet), 4) å blande disse to sett av mikrober på fast medium, 5) identifisere og isolere putative induserende organismer, og 6) som bekrefter at disse organismer gjør faktisk aktivere denne fenotype i en sekundær skjerm. Når identifisert, disse organismene og deres metabolitter gi oss med kjemiske verktøy å modulere bakteriell atferd, for å studere bakteriefysiologi og mikrobielle interaksjoner, og til potensielt fungere som nye stillaser for fremtidige terapeutiske forbindelser.

Protocol

En. Velg en reporter gen og Konstruer en Fluorescent Transkripsjonell Reporter

For B. subtilis:

1. Se Jove artikkelen i referanse ¹⁹ for en protokoll som beskriver konstruksjonen av fluorescerende transkripsjon reportere i Bacillus subtilis.

For andre bakteriearter:

1. Identifisere et gen som blir oppregulert i løpet av den fysiologiske responsen av interesse. Dette kan være basert på eksisterende litteratur eller i transkripsjonen analyse av mikrobe under bestemte forhold.
2. Konstruer en fluorescerende transcriptional reporter for dette genet til å fungere som en proxy for endring i fenotype. Denne konstruksjonen skal omfatte promotoren av denne oppregulert genet drivende fremstilling av en egnet fluorescerende protein (se figur 1).
3. Integrere denne konstruksjon i en nøytral locus på kromosom. Dette sikrer at innfødte regbefolkningens av genet av interesse er ikke forstyrret, og unngår behovet for plasmid seleksjonsmekanismer (f.eks antibiotika) som kan påvirke veksten av miljømessige mikrober.

2. Bestem coculture betingelser

For B. subtilis P _tapa-YFP reporter:

1. Bruk 0.1x LB, Lennox (1 g trypton, 0,5 g gjærekstrakt, 0,5 g NaCl per liter) medium for denne reporteren, siden B. subtilis matrise-produksjon er minimal på Luria buljong ^20. Dette mediet tillater B. subtilis koloniene å vokse til Submillimeter men observerbar størrelse, samtidig som mangfoldig taxa fra jord å vokse ^fem.
2. Inkluder 100 mm MOPS buffer for å minimere mulige pH-endringer.

For andre bakteriearter:

1. Bruk publisert transcriptional data eller empirisk teste ulike kultur vilkår for å identifisere en hvor mikroben vokser men activation av det fluorescerende reporter er ubetydelig (for å tillate aktivering dens til å bli detektert når reporteren stammen dyrkes i coculture med induserende bakterier.)
2. Bruk et medium med lavt innhold av næringsstoffer (i forhold til tradisjonelt rike mikrobiologiske media) ved screening miljø mikrober fra oligotrofe miljøer (for eksempel jord), da mange oligotrofe bakterier vokser ikke når fram med høy næringsforhold ^21. En lav næringsmedium reduserer også kolonistørrelse og øker gjennomstrømningen av skjermen.
3. Velg et medium med lav bakgrunnsfluorescens og god optisk klarhet.
4. Optimalisere veksttemperatur for å tillate både reporter belastning og miljø mikrober å vokse samtidig.
5. Betrakt tilsetning av et bufferingsmiddel. Bruken av buffer i platene vil redusere muligheten for detektering av pH-medierte endringer i fysiologi ^22, med mindre slike interaksjoner er av interesse.

Tre. Forbered Reporter Aliquoter

For B. subtilis P _tapa-YFP reporter:

1. Streak reporter belastning fra -80 ° C frossen lager på en frisk LB plate ved hjelp av en steril tannpirker eller applikator pinne.
2. Vokse over natten ved 30 ° C.
3. Utfør seriefortynning i flytende kultur for å minimere bakgrunn fluorescens som følge av veksten på et solid medium:
   1. Inokuler en 5 ml flytende kultur til LB og vokse med risting ved 37 ° C.
   2. Når kulturen kommer en OD ₆₀₀ ~ 0,6, tynnes i 5 ml frisk LB til en OD ₆₀₀ på 0,02.
   3. Vokse ved 37 ° C igjen med risting før kulturer når OD ₆₀₀ ~ 0,6.
   4. Gjenta serievekst fortynninger totalt 3x.
   5. La endelig serie fortynning kultur vokse til OD ₆₀₀ ~ 0,4.
4. Legg glyserol til 15-20%.
5. Delmengde 50-200 pl i 0,5 ml mikrofuge-rør, og fryses ved -80 ° C.
6. Make tilsvar alikvoter for nonfluorescent ordnede belastningen av reporteren (de vil være nødvendig i løpet av sekundærscreening).

For andre bakteriearter:

1. Bruk celler som har en lav bakgrunnsfluorescens (dvs. dyrkes under betingelser hvor det er lite ekspresjon fra promoteren som brukes i reporter).
2. Lag og fryse alikvoter inneholdende kjente cfu / ml (kolonidannende enheter per ml) av reporter belastningen, slik at et passende antall kolonier kan dyrkes på hver coculture silplaten (se avsnittet ovenfor for detaljer).
3. Gjør tilsvarende porsjoner for nonfluorescent ordnede belastningen (de vil være nødvendig i løpet av sekundærscreening).

4. Skaffe Jordprøver

1. Samle jord i sterile koniske rør eller sterile poser ved hjelp av en slikkepott, forkaster de beste 0,5 cm av eksponert overflatejord.
2. Legg steril saltløsning (0,85% NaCl) i et forhold på 10 ml per 1 gav jord for å lage en jord slurry.
3. Velg en metode for å fjerne bakterier fra jordpartikler: a) umiddelbar bruk av frisk prøve eller b) forsinket bruk etter frysing av prøven.
   1. For umiddelbar bruk, vortex oppslemming i 1 min.
   2. For forsinket bruk, blande jord slurry i blender for tre 1 min sykluser, plassere mikserbollenen på is for 1 min hviler mellom blending sykluser.
4. La jord slurry bosette for ~ 1 min.
5. Beveg øvre vandige lag til et friskt rør.
6. Til glyserol til en sluttkonsentrasjon på 15-20%.
7. Delmengde 50-200 pl i 0,5 ml mikrofuge-rør, og fryses ved -80 ° C.

5. Bestem cfu / ml Frozen reporter og Jord Aliquoter

1. Tine en frossen jord og reporter delmengde. Jord mikrober kan tines på is. Fordi B. subtilis lyserer ved 4 ° C, bør disse alikvotene tines raskt på RT for å minimere tiden brukt ved lav temperatur.
2. Gjør to replikere serial fortynninger (til 10 ^-8) i 0.1x LB eller annen isotonisk buffer.
3. Plate 5 pl flekker av hver seriefortynning på agarplater på samme medium som skal brukes for coculture screening.
4. Grow ved RT (eller temperaturen som skal bruke for screening).
5. Den neste dagen, å telle antallet kolonier i hver flekk og beregne cfu / ml av hver av de frosne alikvoter.

6. Bekreft Delmengde Konsentrasjoner for Spread Screen Plates

1. Tine en frossen delmengde som i trinn 5.1.
2. Fortynn til 1 x 10 ⁵ 2,5 x 10 ^5, 5 x 10 ^5, 1 x 10 ^{til 6,} og 2,5 x 10 ⁷ cfu / ml.
3. Tilsett 50 mL flekk av hver fortynning til sentrum av individuelle plater. Disse bør gi plater med det beregnede optimum på 25 000 kolonier per plate, så vel som 2 - og 5 - ganger mer eller mindre, slik at den beste aktuelle fortynning som skal bestemmes.
4. Tilsett ca 20 sterile glass (3 mm) perler avforsiktig trykke dem inn på plate. Perler gi en mer jevn fordeling av kolonier på tvers av platen enn en bøyd glass spreder gjør.
5. Spre celler ved å holde platene på benkeplaten og riste dem frem og tilbake, rotere dem mens du arbeider, til væsken er absorbert. Ikke fortsett riste perlene når platen er tørr, ellers vil det begynne å drepe bakteriene.
6. Vend plater over og kaste perler inn avfall begerglass som inneholder etanol.
7. La platene vokser for tiden av din analyse (f.eks 24 timer) ved riktig temperatur for analysen (f.eks 24 ° C / RT).
8. Ved hjelp av en dissekere stereoskop, telle antall kolonier i to eller flere synsfelt.
9. Beregn antall kolonier per område, og å bestemme hvor mange kolonier på hver plate.
10. Juster fremtidige fortynninger som nødvendig. Det faktiske antall av kolonier er ikke så viktig som å ha det samme antall på hver tilsvar silplaten.

1. Tine reporter delmengde (og jord delmengde om frosset) som i trinn 5.1.
2. Spe reporter (for konsentrasjoner optimalisert i seksjon 6) i 0.1x LB eller andre lav næringsstoff, isotonisk løsning.
   1. For frossen jord: Fortynn til konsentrasjon optimalisert i § 6 i 0.1x LB eller andre lav næringsstoff, isotonisk løsning.
   2. For frisk jord: Lag fortynninger av frisk jord oppslemming, basert på prediksjon at cfu / ml av jord oppslemmingen kan variere fra 10 ^-4 til 10 ^-9 cfu / ml.
3. Spot 50 mL av jord og reporter fortynninger ut mot midten av coculture skjermen plate. Også plate jord alene og reporter alene som kontroller.
4. Fordel ved hjelp av glassperler som er beskrevet i trinn 6.4 til 6.6.
5. Hvis det er kjente vekstvilkår som aktiverer din fluorescerende reporter, strek eller tallerkenen din reporter under disse forholdene, og vokse til å bruke som en positiv kontroll under screening. Inkuber ved 24 ° C i 24 - 28 timer (eller hva som passer for din reporter / analyse)

8. Screen coculture Plater fluorescens

1. Ved hjelp av lysfelt belysning, fokusere stereoscope slik at koloniene er skarpe.
2. Se på jord-bare plater for å finne ut om jordprøve har autofluorescent kolonier. I så fall kan dette jord resultere i en høy forekomst av falske positiver (med en samtidig økning i sekundær screening).
   1. Bruk en høy andel av reporter: jord i dine coculture plater for å øke sjansen for at en induktor vil være omgitt av flere reporter kolonier, reduserer sjansen de vil bli oppdaget som falske positiver (figur 2).
   2. Bruk et annet fluorescerende protein (en som sender ut i en annen kanal).
3. Bestem analysen timing. For de fleste nye journalister, er tidspunktet for potensiell induksjon ukjent, og dermed må bestemmes empirisk.
   1. Begynn screening for fluorescens så snart kolonier blir klart synlig med dissekere stereoskop (forstørrelse 30X ~) og fortsette å undersøke platene periodisk inntil vekst opphører og / eller bakgrunn, fluorescens blir for høy.
   2. Når tidsvinduet for potensielle induksjons bestemmes for en bestemt rapportør, bør det være lik for alle coculture plater inneholdende det reporter, noe som forenkler kontrollen av skjermplatene. For B. subtilis P _tapa-YFP reporter, er det riktig tidspunkt å undersøke platene mellom 24-28 timer etter plating cellene, for B. subtilis P _sspB-YFP reporter, er det mellom 26-32 timer i vekst.
4. Maksimer fluorescens følsomhet:
   1. Sikre din fluorescens dissekere omfang er i et mørkt rom eller omgitt av blendingsgardiner. Induksjon vil trolig være mindre intens enn en konstitutivt produsert FP og krever større sensitivitet å oppdage.
   2. Sett av tid for fluorescens lampe for å stabilisere og øynene dine til å tilpasse seg mørket før du prøver å detektere fluorescens fra coculture plater (minst 1-2 min).
5. Ved hjelp av en positiv kontroll (hvis du har en), sikre at forstørrelsen du bruker lar deg oppdage fluorescens. Forstørrelsen er vanligvis best hvis synsfelt er ca 30-50x typisk koloni diameter (200-400X).
6. Slå av lys og åpne lukkeren for fluorescens.
7. Etter øynene har tilpasset seg mørket, sakte flytte platen frem og tilbake over ditt synsfelt, på jakt etter lyspunkter.
   1. Start fra toppen av platen og bruke en sikksakk-mønster for å bevege platen fra side til side som det beveger seg mot bunnen av platen.
   2. Øv flytte platen i lysfelt å få en følelse for hvor sakte å flytte til plate, og for å være sikker på at du dekker hele suransikt området.
   3. Flytt platen sakte nok til at koloniene ikke blir uskarpt. Det er bedre å oversample overflaten snarere enn miss områder.
   4. Etter en hel sveip, skru platen 90 ° og gjenta. Menneskelige øyne er utrolig god på å oppdage selv svak fluorescens gjennom denne metoden.
8. Hvis du oppdager fluorescens, slutter å bevege platen og gå tilbake og finne den fluorescerende området.
9. Slå lysfelt på sakte, avgjøre om fluorescens er assosiert med en bakteriekoloni (og ikke autofluorescent jord detritus eller mediekomponenter). Hvis så, de nonfluorescent kolonier proksimale til den fluorescerende kolonien er antatte induserende organismer.

9. Isoler Antatte induserende organismer

1. Når indusert (fluorescerende) kolonier har blitt identifisert, isolere disse koloniene utskiller de induserende stoffer.
   1. Hvis en høy nok konsentrasjon av rapportør kolonier vokser på plate(> 0,5:1 reporter: jord cfu), vil de putative induserende kolonier være omgitt av flere fluorescerende kolonier (igjen, se figur 2).
   2. I tilfeller der kompleksiteten i coculture vekst gjør det tvetydig som koloni er den indus, isolere flere potensielle induserende kolonier for senere testing i sekundærskjermen.
2. Lokaliser koloniene du ønsker å plukke i midten av synsfeltet.
   1. Hvis de er nær kanten av tallerkenen, rotere platen slik at leppen av platen er borte fra din dominerende hånd (dvs. hvis du er høyrehendt, sette kanten av tallerkenen til venstre). Dette gjør det mulig å nærme seg koloniene til en lav vinkel, noe som forbedrer nøyaktigheten av plukking.
3. Plasser ferske plater til strek de antatte induserende organismer på i nærheten, samt et avfalls begeret til å forkaste brukte tips inn.
4. Forlater fluorescens lampe på, slår den lyse lys saktevidere, slik at du vil være i stand til å identifisere (ved form og posisjon), den fluorescerende koloni og de omkringliggende antatte induserende organismer. Du må kanskje gå frem og tilbake med lyset et par ganger for å være i stand til å identifisere de koloniene du ønsker å plukke når det ikke er fluorescens og bare sterkt lys.
5. Bruk et glass stang (200 mm lang mm diameter x 5) for å plukke opp en steril, rund 200 mL gel-lasting tips og holde den som en blyant. Dette er det plukking verktøyet du vil bruke til å isolere enkelte kolonier.
6. Hvil ytre håndflaten mot scenen for å stabilisere den på arbeidsflaten. Plasser den andre hånden på den indre, tommelen side av hånden for å stabilisere plukking verktøy.
7. Hvis det er nødvendig, snu igjen mellom fluorescens og lysfelt visninger for å identifisere koloniene du ønsker å plukke.
8. Holde pipettespissen over platen overflaten, flytte det inn i synsfeltet og sentrere det over kolonien du ønsker å plukke. Spissen vil være ute av fokus.
9. Ved hjelp av den ytre kanten av hånden din (som hviler på mikroskopet scenen eller arbeidsflate), drei pipettespissen sakte ned til kolonien for å bli plukket. Berør det veldig lett, prøver å minimere hvor mange andre kolonier spissen kontakter.
10. Uten roterende plukk verktøy, strek på en del av en fersk plate. Spre med en myk touch for å unngå gouging agar. På grunn av at antall celler som overføres ved denne fremgangsmåte er ganske liten (koloniene er mye mindre enn det som vanligvis manipuleres), vil en enkelt sammenhengende strek resultere i isolerte kolonier.
11. Gjenta denne prosessen med andre antatte induserende organismer.
12. Inkuber platene ved 24 ° C (eller temperaturen i analysen).

10. Streak Antatte induserende organismer å oppnå isolerte enkeltkolonier

1. Ved hjelp av et stereoskop, avgjøre - basert på koloni struktur eller morfologi - enten det er forskjellige typer koloni som finnes innenfor hver av din antatte plukket inducing organismer.
   1. Se på koloniene med en scene der du kan belyse koloniene fra både ovenfor, samt nedenfor for å oppdage potensielle koloni forskjeller.
2. Restreak hver annen morfotype på en fersk plate og inkuberes inntil vokst.
3. Restreak en gang til og la vokse. Hvis forskjellige morfotyper vedvarer, fortsetter å restreak til renhet.

11. Retest Antatte induserende organismer i Sekundær skjerm

1. Retest alle de antatte induserende organismer i en sekundær skjerm for å finne ut hvilke aktiverer den fluorescerende transcriptional reporter. Den sekundære Skjermen består av en plen over-mikro av det fluorescerende reporter transcriptional belastning, sammen med styreplater, hvorpå det putative induserende organismer er lappet eller flekket.
2. Sett opp tre identiske plater: en som inneholder en microcolony plenen av fluorescerende transcriptional reporter belastning (på samme konsentrasjon ens ble brukt under coculture screening), én inneholdende et microcolony plen av vill-type moderstammen uten at et fluorescens-reporter, og en som ikke inneholder noe plen.
   1. Markere toppen av baksiden av hver plate for å bestemme plateorientering.
   2. Legg posisjonsmarkører for lapper / flekker; opptil ti putative induserende organismer kan testes på hvert sett av plater (fig. 3).
   3. Tine plen delmengder (reporter og nonfluorescent forelder belastning) som i trinn 5.1.
   4. Fordel 50 ul av en 5 x 10 ⁵ cfu / ml fortynning på plen plater (eller andre optimaliserte fortynninger) ved hjelp av sterile perler som i trinn 6.4.
   5. La platene tørr.
3. Patch eller spot antatte induserende organismer:
   1. Velg lapp hvis en enklere og raskere tilnærming er ønskelig, og det er akseptabelt å ha en mindre presis antall celler deponert. Å lappe:
      1. Trykk på en steril tannpirker til kolonien til test - ikke plukke opp alle cellene.
      2. Patch (lage en liten strek) på den tomme tallerkenen.
      3. Gjenta lapp med fersk tannpirker inn reporter plate.
      4. Gjenta lapp med fersk tannpirker på kontroll plate.
   2. Velg spotting hvis en kvantitativ og reproduserbar metode er ønsket. Spotting tillater antallet celler deponert å bli normalisert (se referanse 5 for fullstendig informasjon), og tillater den relative styrken av de forskjellige induserende organismer som skal sammenlignes. Å få øye på:
      1. Resuspender putative induserende organismer i 1 ml av flytende medier i sterile plast-kyvette.
      2. Ta OD ₆₀₀ av resuspensions.
      3. Ved hjelp av formelen X = 250 ÷ (OD _{600 til} 0,5), legge volumet X for hver resuspensjon til 500 mL av flytende medium for å få en løsning med en OD ₆₀₀ på 0,5. Denne metoden forenkler de nødvendige pipetteringstrinn når du utfører flere fortynninger å normal OD er ​​fordi du kan bruke samme volum (500 mL) for alle dine dilutants.
      4. Sted 1 pl av hver OD-normalisert resuspensjon til hver av de tre plater.
4. La oss vokse ved 24 ° C i 24-28 timer (eller hva som passer for din reporter / analyse).
5. Bruk den fluorescerende dissekere mikroskop for å identifisere antatte induserende organismer som aktiverer din fluorescerende reporter belastning, men ikke foreldrekontroll belastning. Disse isolatene er dine positive treff - miljø mikrober som skiller ut stoffer som induserer din fenotype av interesse.

Representative Results

Denne skjermen ble brukt til å identifisere jordorganismer utskiller stoffer som endrer fysiologi av B. subtilis. Resultatene som beskrives her for å fokusere på det matrise-produserende celletypen B. subtilis, som produserer proteinet og exopolysaccharide som er nødvendig for robust biofilmdannelse i denne bakterien. Vi valgte arrangøren av Tapa-sipW-TASA operon for vår fluorescerende reporter construct (P _tapa-YFP). Denne operon koder proteinet strukturell komponent av matriksen, og er oppregulert under biofilm matrise produksjon ^23.. Vår matrise reporter (figur 1) ble konstruert som tidligere beskrevet ^19.

Tidligere arbeid har vist at B. subtilis produserer matrise som reaksjon på det selvprodusert quorums føler-lignende molekyl surfactin, så vel som rensede metabolitter produsert av andre jordbakterier ^20. Vi var interessert i å utvideSE studier for å undersøke mer generelt som jord mikrober gjøre metabolitter stand til å indusere matrise produksjon i B. subtilis. Vi har valgt å bruke fortynnet LB for vekst, siden dette mediet var allerede kjent for å føre til dårlig matrise produksjon ^20, som gir oss en vekst tilstand der vår reporter stammen var nonfluorescent. Deretter optimalisert antallet kolonier som er egnet for screening under disse vekstbetingelser. For å optimalisere hvert skjerm-plate, er det nødvendig å bestemme hvor mange kolonier vokse fra den frosne jord og reporter aliquoter og hva den riktige konsentrasjon av kolonier og næringsforholdene er. Ideelt sett ønsker vi hver coculture plate for å inneholde et tilsvarende antall av jord-og rapportør kolonier (dvs. et 1:1 forhold av reporter: jord), og for å være nært adskilt, individuelle kolonier. Denne høye andelen av reporter kolonier øker sannsynligheten for at en induktor vil aktivere flere omkringliggende reporter kolonier. Å ha flere acfortsatt deaktivert induser kolonier rundt en antatt indus koloni øker tilliten i pinpointing selve induserende organisme (figur 2). Den næringsinnhold styrer graden av vekst / kolonidannelse, mens fortynningen av inokulum avgjør om de resulterende koloniene blir riktig dispergert. På en standard 10 cm diameter Petri-plate med lav næringsmedium, har vi funnet at omtrent 25.000 kolonier totalt per plate (50 pl av en 5 x 10 ⁵ cfu / ml fortynning) ga best separasjon av B. subtilis kolonier på 0.1x LB MOPS medium (figur 4).

Selv om den beregnede cfu / ml fra de serielle fortynninger gir en omtrentlig konsentrasjon av bakterier i alikvoter, er det nødvendig å sikre at konsentrasjonen av de resulterende koloniene er hensiktsmessig når en hel plate er spredt med cellene. Den beregnede cfu / plate, og selve cfu / plate ikke alltid er identiske (Figur 4

Etter fremstilling av alikvoter av reporter og jord, blandet vi dem på coculture skjermplatene og undersøkte dem til fluorescens ved hjelp av et stereoskop (figur 5). Vi belagt også kontroller som bare ble inokulert med enten jord eller B. subtilis P _tapa-YFP reporter belastning. B. subtilis produserer biofilm matrise (fluorescens) i respons på en rekke mikrober fra jord som vist ved de fluorescerende kolonier i coculture bildet i figur 5.. For jorda vi undersøkte, vi hadde en høy hit priser for P _Tapa-YFP reporter. Som beskrevet i referanse-5, mellom 12 til 67% av isolatene (fra seks forskjellige jordprøver) hadde evnen til å induce fluorescens i P _tapa-YFP reporter belastning. Dette er i motsetning til våre upubliserte resultater fra analoge skjermer ved hjelp av sporulation (P _sspB-YFP) og kompetanse (P _comG-YFP) reportere. Etter omfattende screening (> 200 000 kolonier for hver reporter), ble bare to organismer identifisert som induserer sporulation, mens ingen ble identifisert som induserer kompetanse. Således er de hit priser for forskjellige celletyper er svært variabel og kan være vanskelig å forutsi på forhånd.

Vi deretter plukket individuelle antatte induserende kolonier. Koloniene på coculture skjerm platene er ganske liten på den lave næringsmedium vi anbefaler (Submillimeter diameter). Ikke desto mindre er det mulig å velge nøyaktig og isolere meget små kolonier for hånd (fig. 6) fra inne i en komplisert coculture silplaten. Den manuelle metoden som vi bruker er enkel og krever verken spesialiserte verktøy eller flamme sterilisering. Disse antatte induser koloniene blir deretter restruck til isolasjon. Fordi coculture platene er overfylt med kolonier, er det ikke uvanlig - selv med veldig forsiktig plukke teknikken - å ha mer enn én organisme vokser fra hver antatte indusprøve. Grundig undersøkelse bør tillate isolering av morfologisk distinkte kolonier. Alle putative induserende organismer blir deretter testet i en sekundær skjerm. Positive og negative resultater både fra plasteret og flekk-metoden er vist i figur 3.. Tatt i betraktning deres tett vekst, vår evne til å fysisk samle induserende kolonier fra coculture platene var ganske bra, med ca 50% av koloniene undersøkt i vår sekundære skjermen være sanne positive. Andre resultater fra denne skjermen, samt etterarbeid dukker opp fra det har vært tidligere beskrevet ^fem.

/ Ftp_upload/50863/50863fig1.jpg "/>
Figur 1. Fluorescerende transcriptional reporter konstruksjon. Den blå oval representerer en bakteriecelle, og den stiplede linje representerer dens kromosom. Dette eksempel viser en fluorescerende transkripsjons reporter for fremstilling av matrisen. Den opprinnelige locus forblir intakt (P _{matrise-matrise,} hvor "P", og pilen angir den promoter-regionen), mens rapportørkonstruksjon (P _matrise-YFP) settes inn et annet sted i kromosomet i en nøytral locus.

Figur 2. Idealiserte eksempler på coculture screening resultater med ulike prosenter av reporteren: miljø mikrober. A) Ved hjelp av en lav reporter: miljø mikrobe forhold fører til mer tvetydighet i å identifisere antatte induserende organismer enn når B) En høy reporter: miljø mikrobe-forhold benyttes. De brune sirkler representerer jordorganismer, de røde sirklene representerer induserende jordorganismer, de blå sirklene representerer uninduced reporter kolonier, og de grønne kolonier representerer indusert reporter kolonier. De stiplede røde linjer indikerer aksjonsradius som induserer metabolitt. Stjernene viser nonfluorescent kolonier som - basert på deres nærhet til de fluoriserende kolonier - er antatte induserende organismer og bør plukkes og testes på nytt i den sekundære skjermen.

Figur 3. Sekundær skjerm. A og B) Skjematisk av hvordan å distribuere lappet eller flekket isolerer på sekundære skjermen plater, henholdsvis for B. subtilis matrise reporter. Mer generøs avstand kan være nødvendig for andre journalister eller induserende isolater, depslutter den diffusibility av deres aktive metabolitter. C og D) Representative resultater fra lappet jord isolerer som er negativ og positiv, henholdsvis for å indusere B. subtilis P _{tapa-YFP-reporter.} Topp paneler er lysfelt bilder; lavere paneler er fluorescens bildene. Scale bar er 1 mm. E) Negative og positive resultater fra spotted jord isolerer for samme reporter. Målestokk er 2 mm.

Figur 4. Fastsettelse av microcolony konsentrasjon. Fordelingen og størrelsen på kolonier vil avhenge både av næringssalter og cellekonsentrasjonen. A) Forskjeller i vekst av B. subtilis på 0.01x LB (øverste rad) versus 0.08x LB (nederste rad). Celler på 0.01x LB danner ikke inn-mikro, mens tslangen på 0.08x LB gjøre. (Merk at for våre skjermer vi økte nivåer av næringsstoffer noe fra det som er vist her:. Fra 0.08x LB til 0.1x LB) Disse bildene er fra en mL flekker av sekvensielle 1:05 fortynninger på kjent cfu / ml. Ekstrapolere fra disse konsentrasjonene, for å få tilsvarende fordelinger av kolonier over en 10 cm Petri plate ville kreve plating (fra venstre): 3200000, 640000, og 128000 cfu totalt per plate. Imidlertid spotting resulterer i ujevn fordeling av cellene (de er konsentrert på stedet kanter) i forhold til spre-celler over hele platen. Således, når et næringsstoff konsentrasjon er valgt, er det viktig å undersøke platene spredt med forskjellige konsentrasjoner. Scale bar er 0,1 mm B) Disse panelene viser resultatene av spredning (fra venstre) 50000;. 25 000, og 5000 totalt cfu per plate på 0.08x LB plater. Fra disse bildene, valgte vi 25 000 som vårt mål antall cfu / plate. Scale bar er 0,1 mm.

Figur 5. Coculture av B. subtilis P _tapa-YFP blandet med jordorganismer. Overlay av lysfelt og fluorescens bilde fra en coculture skjermen plate som inneholder B. subtilis P _tapa-YFP matrise reporter blandet med jordorganismer. Arrowhead indikerer antatte indus omgitt av fluorescens reporter-mikro. Scale bar er en mm.

Figur 6. Demonstrasjon av gjennomførbarheten av å isolere små bakteriekolonier fra coculture plater. A og B) Disse panelene viser to felt av lys av agarplater inneholdende komplekse mikrobielle samfunn fra jord. Kolonier så små som 0,1 mm kan bli isolert ved hjelp av teknikken som er beskrevet plukkingher. Topp paneler er synsfeltet før kolonien plukking, og bunnpanelet er de samme synsfelt etter koloni plukking. Røde pilspisser indikere hvor cellene er blitt fjernet.

Discussion

En av de iboende begrensningene i denne protokollen er at den er avhengig av cultivability av mikrobielle organismer. Som det har blitt vel dokumentert ^24, mest mikrobielt liv på planeten kan ikke (ennå) dyrkes under dyrkningsforhold utforsket ennå. Dermed vil et stort antall interaksjoner mellom mikrobielle arter som forekommer i naturlige omgivelser gå ubemerket å bruke denne tilnærmingen. Men siden ønske er å ikke bare å identifisere tilstedeværelsen av slike interaksjoner, men da også studere mekanismene og molekyler som er involvert i formidling av dem, er evnen til å dyrke disse mikrober en nødvendighet. Selv innenfor dyrkbare arter, har dette området vært dårlig utforsket, noe som gjør den tilnærmingen som er beskrevet her et verdifullt bidrag som en metode for å identifisere kjemisk medierte interaksjoner mellom mikrober. I tillegg, selv om denne protokollen er optimalisert for å screene for matriks-induksjon av Bacillus subtilis, kan det teoretisk kan påføres eny transcriptional fluorescerende reporter i noen andre bakteriearter.

En annen relatert begrensning av denne tilnærmingen er at denne skjermen (per definisjon) krever coculture. I naturlige omgivelser, kan mikrober med ulike vekstrater fortsatt eksistere i romlig nærhet samtidig utnytte ulike miljø nisjer. Slike mikrobielle interaksjoner ville gå ubemerket av vår coculture skjermen, men som bare vil tillate vekst av miljø mikrober med næringsbehov og vekstrater som ligner på de av reporter arter. Modifikasjoner som vil skille veksten av de potensielle induserende organismer fra veksten av reporteren belastningen er absolutt mulig. Vi har også forventet at hyfene vekst av sopp - vanlig i jord - kan føre til vanskeligheter i ko-kultur-skjermen. Mens den korte tidsskala av vår skjerm med B. subtilis ment at noen sopper ble detektert, og legger soppdrepende forbindelser til vekstmediet kan minimize denne bekymringen.

Muligheten til å velge en passende fenotype og genet for det fluorescerende reporter konstruksjon bør ikke være vanskelig, tatt i betraktning den mengde sekvensering og transkripsjonelle data enten allerede tilgjengelige eller lett kan fremskaffes i mange bakteriearter. Det er imidlertid en vanskelighet med tilnærmingen beskrives her er det nødvendig å identifisere vekstbetingelser som minimaliserer bakgrunnsfluorescens av reporter belastning, slik at påvisning av fluorescens-induksjon. Identifiseringen av disse forholdene må ofte gjøres empirisk, selv om transkripsjons data kan bistå dette søket (for eksempel de flislegging microarray data tilgjengelig for vekst av B. subtilis tillater identifisering av forhold der gener av interesse er dårlig uttrykt ^10). For noen journalister denne empiriske søk kan være utfordrende, delvis fordi uttrykket av mange bakterielle fenotyper er heterogen. Med andre ord, er det sjelden å finne conditions der ingen celler i populasjonen uttrykker Phenotype X. Således, avhengig av antallet av celler i den undergruppe og styrken av genekspresjon, kan det være vanskelig å identifisere betingelser som gir tilstrekkelig lav bakgrunnsfluorescens å tillate induksjon som skal påvises . Et alternativ til dette empirisk søk ​​etter ideelle screening forhold kan være å "tune" uttrykket nivåer av reporteren hjelp mutagenese. Ved å endre den promoter-regionen og / eller ribosomal bindingssete av rapportørkonstruksjon, kunne bakgrunnsfluorescens nivåer reduseres. Dette kunne utvide nytten av dette skjermbildet ved å tillate selv gener med noen konstitutiv aktivering for å bli undersøkt for induksjon.

Når induserende organismer har blitt identifisert og bekreftet i en sekundær skjerm, kan de bli fylogenetisk identifiseres ved sekvense deres 16S rRNA-genet. Det er også mulig å kvantifisere utstrekningen av elektronisk fCence bruker OD _{600-normalisert} plass i den sekundære skjermen ^fem. Dette kan gi informasjon om hvilke medlemmer av samfunnet produserer stoffer som påvirker din reporter belastning og til hvilken grad. Følgelig kan dette føre til hypoteser om hvilke mikrobielle interaksjoner kan forekommer i naturlige omgivelser og muligheten til å utforske potensialet coevolution av disse produserer og svarer organismer. Andre fremtidige retninger omfatter belyse strukturen av det utskilte molekylet i seg selv, å bestemme mekanismen (e) ved hvilken det reagerer organismen avføler denne forbindelsen, og ved hjelp av den som et kjemisk verktøy for å modulere bakterielle fenotyper.

Selv med de hensyn som er skissert ovenfor, metoden som er beskrevet her er et betydelig bidrag. Det unngår arbeid involvert i å sette sammen et bibliotek av miljø mikrober, men lar sin fysiske separasjon og isolasjon ved hjelp av faste medier. Styrken i denne coculture skjermen er atdet gir en begrepsmessig og teknisk enkel metode for å screene gjennom tusenvis av mikrobielle arter for å identifisere de som utskiller bioaktive forbindelser av interesse som samtidig er anvendelig for mange bakteriearter og fenotyper.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectrophotometer			Any spectrophotomer capable of measuing OD600 absorbance values.
Luria broth, Lennox	VWR	80017-484	Alternative media sources may be necessary.
Glass beads, 3 mm	VWR	26396-508
Gel loading tips, round	VWR	29442-666
Glass rods	VWR	59060-069
Fluorescence dissecting stereoscope	Zeiss	N/A	The author used a Zeiss Stemi SV6 dissection stereoscope with an EXFO X-cite 120 fluorescent light source, a long-pass YFP filter cube, an achromat 0.63X objective, 10X eyepieces, and an Axio HRC HR digital camera. Most screening was done with the focusing mount at 2.0-3.2X. Any dissecting stereoscope with fluorescence capabilities is fine, provided you have the correct filters for the FP you are using. It is best if there is a shutter that allows you to easily switch between brightfield and fluorescense, as well as a stage that allows illumination from above and below. If you want to capture images, an attached camera is also necessary.