La supplémentation alimentaire en acides gras polyinsaturés dans<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
<em> Caenorhabditis elegan </ em> est un modèle utile pour explorer les fonctions d'acides gras polyinsaturés dans le développement et la physiologie. Ce protocole décrit une méthode efficace de compléter la <em> C. elegans </ em> alimentation avec des acides gras polyinsaturés.
Abstract
Les acides gras sont essentiels pour de nombreuses fonctions cellulaires. Ils servent molécules de stockage d'énergie efficaces, forment le noyau hydrophobe des membranes, et de participer à diverses voies de signalisation. Caenorhabditis elegans synthétise toutes les enzymes nécessaires pour produire une gamme d'acides gras oméga-6 et oméga-3 acides gras. Ceci, combiné avec la simple anatomie et la gamme d'outils génétiques disponibles, en font un modèle intéressant pour étudier la fonction des acides gras. Afin d'étudier les voies génétiques qui assurent la médiation des effets physiologiques des acides gras alimentaires, nous avons mis au point un procédé pour compléter l'C. alimentation elegans avec des acides gras insaturés. La supplémentation est un moyen efficace pour modifier la composition en acides gras de vers et peut également être utilisé pour sauver les défauts de mutants déficients en acides gras. Notre méthode utilise la croissance à moyen agar nématode (NGM) additionné de sels gras de acidsodium. Les acides gras présents dans les plaques deviennent incorporation complétéested dans les membranes de la source d'alimentation bactérienne, qui est ensuite reprise par le C. elegans qui se nourrissent de bactéries complétées. Nous décrivons également un protocole de Chromatographie en phase gazeuse pour contrôler les changements dans la composition d'acide gras qui se produisent dans les vers complétés. C'est un moyen efficace de compléter les régimes de grandes et de petites populations de C. elegans, permettant une gamme d'applications de cette méthode.
Introduction
Les acides gras sont des composants structurels essentiels des membranes ainsi que des molécules de stockage d'énergie efficace. En outre, les acides gras peuvent être clivés à partir de membranes cellulaires par des lipases et peuvent être modifiées par voie enzymatique pour produire des effecteurs de signalisation 1. D'origine naturelle des acides gras polyinsaturés (AGPI) contiennent deux ou plusieurs doubles liaisons cis. Les acides gras oméga-3 acides gras et les acides gras oméga-6 se distinguent l'une de l'autre sur la base des positions des doubles liaisons par rapport à l'extrémité méthyle de l'acide gras. Une alimentation saine exigent à la fois acides gras oméga-6 et oméga-3 acides gras. Cependant, les régimes occidentaux sont particulièrement riches en acides gras oméga-6 acides gras et pauvres en oméga-3 acides gras. Une haute teneur en oméga-6 et oméga-3 ratio d'acide gras est associée à un risque accru de maladies cardiovasculaires et inflammatoires, cependant, les fonctions bénéfiques et nuisibles précis d'acides gras spécifiques ne sont pas bien comprises 2. Les ascaris elega Caenorhabditisns est utile pour étudier la fonction des acides gras, car il synthétise toutes les enzymes nécessaires pour produire une gamme d'acides gras oméga-6 et oméga-3 acides gras, y compris une oméga 3 désaturase, une activité qui est absente dans la plupart des animaux 3,4. Mutants dépourvus enzymes désaturase d'acide gras ne parviennent pas à produire des PUFA spécifiques, conduisant à une série de défauts de développement et neurologiques 4-6.
Pour étudier les effets physiologiques des acides gras alimentaires, nous avons développé un dosage biochimique compatible avec l'analyse génétique en utilisant les deux techniques knock-down ARNi mutant et C. elegans. La supplémentation avec des PUFA spécifiques est obtenue en ajoutant une solution de sel de sodium d'acide gras dans le milieu d'agar avant la coulée. Cela se traduit par l'absorption par le PUFA E. source de nourriture coli, où il s'accumule dans les membranes bactériennes. C. elegans ingèrent les bactéries contenant des AGPI, et ce complément alimentaire est suffisante pour sauver le défectueuxts de mutants déficients en AGPI. La supplémentation de la plupart des acides gras n'a pas d'effets néfastes sur les animaux de type sauvage, cependant, oméga-6 acides gras spécifiques, en particulier l'acide dihomo-gamma-linolénique (DGLA, 20:03 n-6) causer une destruction permanente de C. elegans cellules germinales 7,8.
Chromatographie en phase gazeuse est utilisé pour surveiller l'absorption de l'acide gras complétée dans la source de nourriture bactérienne (soit OP50 ou HT115), ainsi que dans les nématodes. L'addition du Tergitol de détergent (NP-40) dans le support permet d'obtenir une distribution uniforme des acides gras à travers toute la plaque et l'utilisation plus efficace des acides gras par le E. coli et les nématodes. Nous avons découvert que les acides gras insaturés sont facilement absorbés par les bactéries et C. elegans, mais l'absorption d'acides gras saturés est beaucoup moins efficace. Cet article décrit étape par étape comment compléter les médias agar avec des acides gras, ainsi que la façon de contrôler l'absorption des acides gras dans le ee nématode par chromatographie en phase gazeuse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous décrivons une méthode de supplémentation de C. elegans avec des acides gras insaturés alimentaires. Comme mentionné ci-dessus, il faut prendre soin dans la préparation de plaques PUFA supplémenté en raison de la nature réactive des doubles liaisons dans les acides gras polyinsaturés des causes de ces acides gras pour être sensible à l'oxydation par la chaleur et de la lumière 11. Pour éviter l'oxydation, il est important d'ajouter le PUFA dans le milieu de gélose …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Chris Webster pour effectuer les expériences préliminaires de la figure 3 des résultats représentatifs et Jason Watts et Chris Webster des commentaires utiles sur le manuscrit. Le financement de cette étude a été fourni par une subvention des National Institutes of Health (USA) (R01DK074114) à JLW. Certaines souches de nématodes utilisés dans ce travail ont été fournies par le Centre de Génétique Caenorhabditis, qui est financé par le Bureau NIH des programmes d'infrastructure de recherche (P40 de OD010440).
Materials
| Bacto-Agar | Difco | 214010 | |
| Tryptone | Difco | 211705 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624-05 | |
| Tergitol | Sigma | NP40S-500mL | |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | (5 mg/mL in ethanol) |
| MgSO4 | J.T. Baker | 2504-01 | |
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3254-05 | |
| KH2PO4 | J.T. Baker | 3246-05 | |
| Sodium dihomogamma linolenate | NuCHEK | S-1143 | |
| Warm sterile Millipore water | |||
| Sterile water for collecting worms | |||
| Nuclease-free Water for DGLA stock solution | Ambion | AM9932 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | 100 mg/ml in water (for RNAi plates) |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Gold Biotechnology | 12481C100 | 1 M in water (for RNAi plates) |
| HSO4 | J.T. Baker | 9681-03 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Hexane | Fisher Scientific | H302-4 | |
| diamindinophenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| VectaShield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Glass Flask | Corning | 4980-2L | |
| Autoclaveable Glass bottles with stirbars | Fisherbrand | FB-800 | |
| Autoclaveable Glass Graduated Cylinder | Fisherbrand | 08-557 | |
| Stir Plate | VWR | 97042-642 | |
| Waterbath at 55+ °C | Precision Scientific Inc. | 66551 | |
| Screwcap Brown Glass Vial | Sun SRI | 200 494 | |
| Argon gas tank | |||
| Automated Pipette aid | Pipette-Aid | P-90297 | |
| Sterile Serological Pipettes (25 ml) | Corning | 4489 | |
| Bunsen Burner | VWR | 89038-534 | |
| Dissection microscope | Leica | TLB3000 | |
| Silanized glass tube | Thermo Scientific | STT-13100-S | for FAMEs derivitization |
| PTFE Screw caps | Kimble-Chase | 1493015D | |
| Clinical tabletop centrifuge | IEC | ||
| GC Crimp Vial | SUN SRi | 200 000 | |
| GC Vial Insert | SUN SRi | 200 232 | |
| GC Vial cap | SUN SRi | 200 100 | |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890A | |
| Mass Spectrometry Detector | Agilent | 5975C | |
| Column for gas chromatography | Suppelco | SP 2380 | 30 m x 0.25 mm fused silica capillary column |
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