La suplementación dietética de ácidos grasos poliinsaturados en<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
<em> Caenorhabditis elegan </ em> es un modelo útil para explorar las funciones de los ácidos grasos poliinsaturados en el desarrollo y la fisiología. Este protocolo describe un método eficiente de complementar la <em> C. elegans </ em> la dieta con ácidos grasos poliinsaturados.
Abstract
Los ácidos grasos son esenciales para muchas funciones celulares. Sirven moléculas de almacenamiento de energía en forma eficiente, constituyen el núcleo hidrofóbico de las membranas, y participar en las diversas vías de señalización. Caenorhabditis elegans sintetiza todas las enzimas necesarias para producir una gama de ácidos grasos omega-6 y omega-3 los ácidos grasos. Esto, combinado con la simple anatomía y la gama de herramientas genéticas disponibles, lo convierten en un modelo atractivo para estudiar la función del ácido graso. Con el fin de investigar las vías genéticas que median en los efectos fisiológicos de los ácidos grasos de la dieta, hemos desarrollado un método para complementar la C. elegans dieta con ácidos grasos insaturados. La suplementación es un medio eficaz para alterar la composición de ácidos grasos de gusanos y también se puede utilizar para rescatar los defectos en los mutantes deficientes en ácido grasos. Nuestro método utiliza el crecimiento medio de agar nematodo (NGM) suplementado con sales de acidsodium graso. Los ácidos grasos en las placas suplementadas se convierten en incorporaciónTed en las membranas de la fuente de alimento bacteriana, que luego es absorbido por la C. elegans que se alimentan de las bacterias suplementadas. También se describe un protocolo de cromatografía de gases para monitorear los cambios en la composición de ácidos grasos que se producen en los gusanos suplementados. Esta es una manera eficaz para complementar las dietas de las poblaciones grandes y pequeñas de C. elegans, lo que permite una gama de aplicaciones para este método.
Introduction
Los ácidos grasos son componentes estructurales esenciales de las membranas, así como moléculas de almacenamiento de energía eficiente. Adicionalmente, los ácidos grasos pueden ser escindidos a partir de membranas celulares por las lipasas y pueden modificar enzimáticamente para producir efectores de señalización 1. De origen natural los ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs) contienen dos o más enlaces dobles cis. Los ácidos grasos omega-3 y los ácidos grasos omega-6 se distinguen unos de otros sobre la base de las posiciones de los dobles enlaces con respecto al extremo metilo del ácido graso. Las dietas saludables requieren tanto de omega-6 y ácidos grasos omega-3. Sin embargo, las dietas occidentales son especialmente ricos en ácidos grasos omega-6 y pobres en ácidos grasos omega-3. Un alto contenido de omega-6 proporción de ácidos grasos omega-3 que se asocia con un mayor riesgo de enfermedades cardiovasculares e inflamatorias, sin embargo, las funciones beneficiosas y perjudiciales precisas de ácidos grasos específicos no se conocen bien 2. Las lombrices intestinales Elega Caenorhabditisns es útil en el estudio de la función de ácido graso, ya que sintetiza todas las enzimas necesarias para producir una gama de ácidos grasos omega-6 y omega-3 grasos, incluyendo una desaturasa omega-3, una actividad que está ausente en la mayoría de los animales 3,4. Los mutantes que carecen de las enzimas ácido graso desaturasa fallan para producir PUFA específicos, dando lugar a una serie de defectos en el desarrollo y neurológicos 4-6.
Para estudiar los efectos fisiológicos de los ácidos grasos de la dieta, hemos desarrollado un ensayo bioquímico compatible con el análisis genético utilizando tanto técnicas de derribo de RNAi mutante y en C. elegans. La suplementación con PUFA específicos se logra mediante la adición de una solución de sal de sodio de ácido graso para el medio de agar antes de verter. Esto resulta en la absorción de ácidos grasos poliinsaturados por el E. fuente de alimento coli, donde se acumula en las membranas bacterianas. C. elegans ingieren las bacterias que contienen PUFA, y esto los suplementos dietéticos es suficiente para rescatar el defectuosoct de mutantes deficientes en ácidos grasos poliinsaturados. La suplementación de la mayoría de los ácidos grasos no tiene efectos perjudiciales sobre los animales de tipo salvaje, sin embargo, los ácidos grasos específicos de omega-6, especialmente el ácido dihomo-gamma-linolénico (DGLA, 20:03 n-6) causar una destrucción permanente de C. células germinales elegans 7,8.
La cromatografía de gases se utiliza para controlar la absorción del ácido graso complementado en la fuente de alimento bacteriana (ya sea OP50 o HT115), así como en los nematodos. La adición de la Tergitol detergente (NP-40) en los medios de comunicación permite una distribución uniforme de los ácidos grasos a través de la placa entera y la absorción más eficiente de los ácidos grasos por la E. coli y los nematodos. Hemos encontrado que los ácidos grasos insaturados son fácilmente absorbidos por las bacterias y C. elegans, pero la absorción de ácidos grasos saturados es mucho menos eficiente. Este artículo describirá paso a paso cómo complementar los medios de agar con ácidos grasos, así como la forma de controlar la absorción de ácidos grasos en the nematodo mediante cromatografía de gases.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí se describe un método para la suplementación de C. elegans con ácidos grasos insaturados. Como se mencionó anteriormente, se debe tener cuidado en la preparación de platos PUFA complementados porque la naturaleza reactiva de los dobles enlaces en PUFAs hace que estos ácidos grasos para ser sensibles a la oxidación a través del calor y de la luz 11. Para evitar la oxidación, es importante agregar el PUFA al medio de agar líquido después de los medios de comunicación se ha enfriado a …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a Chris Webster para la realización de los experimentos preliminares muestran en la Figura 3 de los resultados representativos y Jason Watts y Chris Webster útil para los comentarios sobre el manuscrito. Los fondos para este estudio fue proporcionado por una beca de los Institutos Nacionales de Salud (Estados Unidos) (R01DK074114) a JLW. Algunas cepas de nematodos utilizadas en este trabajo fueron proporcionados por el Centro de Genética Caenorhabditis, que es financiado por la Oficina de NIH de los programas de infraestructuras de investigación (OD010440 P40).
Materials
| Bacto-Agar | Difco | 214010 | |
| Tryptone | Difco | 211705 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624-05 | |
| Tergitol | Sigma | NP40S-500mL | |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | (5 mg/mL in ethanol) |
| MgSO4 | J.T. Baker | 2504-01 | |
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3254-05 | |
| KH2PO4 | J.T. Baker | 3246-05 | |
| Sodium dihomogamma linolenate | NuCHEK | S-1143 | |
| Warm sterile Millipore water | |||
| Sterile water for collecting worms | |||
| Nuclease-free Water for DGLA stock solution | Ambion | AM9932 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | 100 mg/ml in water (for RNAi plates) |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Gold Biotechnology | 12481C100 | 1 M in water (for RNAi plates) |
| HSO4 | J.T. Baker | 9681-03 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Hexane | Fisher Scientific | H302-4 | |
| diamindinophenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| VectaShield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Glass Flask | Corning | 4980-2L | |
| Autoclaveable Glass bottles with stirbars | Fisherbrand | FB-800 | |
| Autoclaveable Glass Graduated Cylinder | Fisherbrand | 08-557 | |
| Stir Plate | VWR | 97042-642 | |
| Waterbath at 55+ °C | Precision Scientific Inc. | 66551 | |
| Screwcap Brown Glass Vial | Sun SRI | 200 494 | |
| Argon gas tank | |||
| Automated Pipette aid | Pipette-Aid | P-90297 | |
| Sterile Serological Pipettes (25 ml) | Corning | 4489 | |
| Bunsen Burner | VWR | 89038-534 | |
| Dissection microscope | Leica | TLB3000 | |
| Silanized glass tube | Thermo Scientific | STT-13100-S | for FAMEs derivitization |
| PTFE Screw caps | Kimble-Chase | 1493015D | |
| Clinical tabletop centrifuge | IEC | ||
| GC Crimp Vial | SUN SRi | 200 000 | |
| GC Vial Insert | SUN SRi | 200 232 | |
| GC Vial cap | SUN SRi | 200 100 | |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890A | |
| Mass Spectrometry Detector | Agilent | 5975C | |
| Column for gas chromatography | Suppelco | SP 2380 | 30 m x 0.25 mm fused silica capillary column |
References
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