La suplementación dietética de ácidos grasos poliinsaturados en Caenorhabditis elegans

Summary

Caenorhabditis elegan es un modelo útil para explorar las funciones de los ácidos grasos poliinsaturados en el desarrollo y la fisiología. Este protocolo describe un método eficiente de complementar la C. elegans la dieta con ácidos grasos poliinsaturados.

Abstract

Los ácidos grasos son esenciales para muchas funciones celulares. Sirven moléculas de almacenamiento de energía en forma eficiente, constituyen el núcleo hidrofóbico de las membranas, y participar en las diversas vías de señalización. Caenorhabditis elegans sintetiza todas las enzimas necesarias para producir una gama de ácidos grasos omega-6 y omega-3 los ácidos grasos. Esto, combinado con la simple anatomía y la gama de herramientas genéticas disponibles, lo convierten en un modelo atractivo para estudiar la función del ácido graso. Con el fin de investigar las vías genéticas que median en los efectos fisiológicos de los ácidos grasos de la dieta, hemos desarrollado un método para complementar la C. elegans dieta con ácidos grasos insaturados. La suplementación es un medio eficaz para alterar la composición de ácidos grasos de gusanos y también se puede utilizar para rescatar los defectos en los mutantes deficientes en ácido grasos. Nuestro método utiliza el crecimiento medio de agar nematodo (NGM) suplementado con sales de acidsodium graso. Los ácidos grasos en las placas suplementadas se convierten en incorporaciónTed en las membranas de la fuente de alimento bacteriana, que luego es absorbido por la C. elegans que se alimentan de las bacterias suplementadas. También se describe un protocolo de cromatografía de gases para monitorear los cambios en la composición de ácidos grasos que se producen en los gusanos suplementados. Esta es una manera eficaz para complementar las dietas de las poblaciones grandes y pequeñas de C. elegans, lo que permite una gama de aplicaciones para este método.

Introduction

Los ácidos grasos son componentes estructurales esenciales de las membranas, así como moléculas de almacenamiento de energía eficiente. Adicionalmente, los ácidos grasos pueden ser escindidos a partir de membranas celulares por las lipasas y pueden modificar enzimáticamente para producir efectores de señalización ^1. De origen natural los ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs) contienen dos o más enlaces dobles cis. Los ácidos grasos omega-3 y los ácidos grasos omega-6 se distinguen unos de otros sobre la base de las posiciones de los dobles enlaces con respecto al extremo metilo del ácido graso. Las dietas saludables requieren tanto de omega-6 y ác....

Protocol

Los ácidos grasos poliinsaturados son sensibles al calor, la luz y el oxígeno. Por lo tanto, se debe tener cuidado en la preparación de platos de suplementos de ácidos grasos tales que los ácidos grasos no están expuestos a un exceso de calor y luz. Medios NGM que contienen 0,1% de Tergitol (NP-40) se trata en autoclave y se enfría parcialmente, después de lo cual las sales de sodio de ácidos grasos se añaden con agitación constante. Las placas se dejaron secar en la oscuridad. La absorción de los ácidos grasos por C. elegans cultivadas en estas placas a continuación pueden ser monitoreados mediante cromatografía de gases.

1. Prepa....

Results

La suplementación de la C. dieta elegans está limitada por la capacidad de la fuente de alimento de las bacterias a la absorción e incorporar los ácidos grasos en la membrana bacteriana. Para determinar la capacidad de E. OP50 coli para asimilar diversos ácidos grasos en sus membranas, OP50 se cultivó en placas sobre medios con ningún suplemento, 0,1 mM y concentraciones de 0,3 mM de ácido esteárico (18:0), oleato de sodio (18:1 n-9), y el DGLA de sodio (20 : 3n-6). Las placas se seca.......

Discussion

Aquí se describe un método para la suplementación de C. elegans con ácidos grasos insaturados. Como se mencionó anteriormente, se debe tener cuidado en la preparación de platos PUFA complementados porque la naturaleza reactiva de los dobles enlaces en PUFAs hace que estos ácidos grasos para ser sensibles a la oxidación a través del calor y de la luz ^11. Para evitar la oxidación, es importante agregar el PUFA al medio de agar líquido después de los medios de comunicación se ha enfriado a 55 ° C y las .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto-Agar	Difco	214010
Triptona	Difco	211705
NaCl	J.T. Baker	3624-05
Tergitol	Sigma	NP40S-500mL
Colesterol	Sigma	C8667-25G	(5 mg/mL en etanol)
MgSO4	J.T. Baker	2504-01
CaCl2	J.T. Baker	1311-01
K2HPO4	J.T. Baker	3254-05
KH2PO4	J.T. Baker	3246-05
Linolenato de dihomogamma sodio	NuCHEK	S-1143
Agua	Millipore tibia y estéril
Agua estéril para la recolección de lombrices
Agua sin nucleasas para solución madre de DGLA	Ambion	AM9932
Ampicilina	Fisher Scientific	BP1760-25	100 mg/ml en agua (para placas de ARNi)
Isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG)	Gold Biotechnology	12481C100	1 M en agua (para placas de ARNi)
HSO4	J.T. Baker	9681-03
Metanol	Fisher Scientific	A452-4
Hexano	Fisher Scientific	H302-4
diamindinofenilindol (DAPI)	Sigma	D9542
VectaShield	Vector Laboratories	H-1000
Matraz de vidrio	Corning	4980-2L
Botellas de vidrio esterilizables en autoclave con barras agitadoras	Fisherbrand	FB-800
Cilindro graduado de vidrio esterilizable en autoclave	Fisherbrand	08-557
Placa de agitación	VWR	97042-642
Baño de agua a 55+ & grados; C	Precisión Científica Inc.	66551
Tapón de rosca Vial de vidrio marrón	Sun SRI	200 494
			gas argón
Automatizado Ayuda para pipetas	Pipete-Aid	P-90297
Pipetas serológicas estériles (25 ml)	Corning	4489
Bunsen Burner	VWR	89038-534
Microscopio de disección	Leica
Tubo de vidrio silanizado	Thermo Scientific	STT-13100-S	para derivación de
FAME Tapones de rosca de PTFE	Kimble-Chase	1493015D
Centrífuga de mesa clínica	IEC
GC Vial de crimpado	SUN SRi	200 000
GC Inserto de vial	SUN SRi	200 232
GC Tapón de vial	SUN SRi	200 100
Cromatógrafo de gases	Agilent	7890A Detector de
espectrometría de masas	Agilent	5975C
Columna para cromatografía de gases	Suppelco	SP 2380	Columna capilar de sílice fundida de 30 m x 0,25 mm