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Summary
<em> 사용 Caenorhabditis의의 우 •은 </ EM은> 개발 및 생리학에 고도 불포화 지방산의 기능을 탐구 할 수있는 유용한 모델입니다. 이 프로토콜의 <em> C.의 보충의 효율적인 방법을 개시 엘레 </ EM> 고도 불포화 지방산 다이어트.
Abstract
지방산은 다수의 세포 기능에 필수적이다. 이들은 세포막의 소수성 코어를 구성하고, 다양한 신호 전달 경로에 참여하는 등 효율적인 에너지 저장 분자를 봉사. Caenorhabditis의 엘레 오메가 -6와 오메가 -3 지방산의 범위를 생산하는 데 필요한 효소를 모두 합성한다. 이것은 간단한 해부학 가능한 유전 도구의 범위와 함께, 그것은 지방산의 기능을 연구하는 매력적인 모델합니다. 식물 지방산의 생리 학적 효과를 매개하는 유전자 전달 경로를 조사하기 위해, 우리는 C.를 보완하는 방법을 개발했다 불포화 지방산 elegans의 다이어트. 보충제 웜의 지방산 조성을 변경하는 효과적인 수단이며, 또한 지방산 결핍 돌연변이 체의 결함을 구하기 위해 사용될 수있다. 우리의 방법은 지방 acidsodium 소금으로 보충 선충의 성장 매체 한천 (NGM)를 사용합니다. 보충 판에있는 지방산은 incorpora가테드 다음 C.에 의해 흡수되어 세균의 음식 소스의 세포막에 보충 박테리아에 먹이 엘레. 또한 보충 웜 발생 지방산 조성의 변화를 모니터링하기 위해 가스 크로마토 그래피 프로토콜을 설명한다. 이것은 C의 크고 작은 집단의 다이어트를 보완 할 수있는 효율적인 방법입니다 엘레,이 방법에 대한 응용 프로그램의 범위에 대한 허용.
Introduction
지방산은 세포막의 필수 구조적 구성 요소뿐만 아니라 효율적인 에너지 저장 분자이다. 또한 지방산은 리파제에 의해 세포막에서 절단 될 수 있고, 효소 적 시그널링 이펙터 하나를 생성하도록 변형 될 수있다. 자연적으로 발생하는 고도 불포화 지방산 (PUFAs에)는 두 개 이상의 시스 이중 결합을 포함하고 있습니다. 오메가 -3 지방산과 오메가 -6 지방산은 지방산의 메틸 말단에 대하여 이중 결합의 위치에 기초하여 서로 구별된다. 건강한 식단은 오메가 -6와 오메가 -3 지방산을 모두 필요로한다. 그러나, 서양 식단은 오메가 -6 지방산과 오메가 -3 지방산이 가난한 특히 풍부하다. 높은 오메가 -6 오메가 -3 지방산 비율은 심장 혈관 및 염증성 질환의 위험이 증가하지만, 특정 지방산의 정확한 유익하고 해로운 기능이 잘 이해되지와 연관된다. 거위 Caenorhabditis의의 ELEGA그것은 오메가 -3 불포화, 대부분의 동물 3,4 부재 활동 등 오메가 -6와 오메가 -3 지방산의 범위를 생성하는 데 필요한 효소를 모두 합성 때문에 NS 지방산 기능 연구에 유용하다. 지방산 불포화 화 효소 결핍 돌연변이 발생 및 신경 학적 결함 4-6의 범위에 이르는, 특정 된 PUFA를 생산하지 못한다.
식이 지방산의 생리 학적 효과를 연구하기 위해, 우리는 C.에 돌연변이 및 RNAi의 노크 다운 기술을 모두 사용하여 유전자 분석과 호환되는 생화학 적 분석을 개발했다 엘레. 특정 된 PUFA와 보충제는 이전에 붓는 한천 배지에 지방산 나트륨 염 용액을 첨가함으로써 달성된다. 이는 E. 의해 PUFA 흡수 초래 이 세균의 세포막에 축적 대장균 음식 소스. C. 엘레는 PUFA 함유 박테리아를 섭취하고,이식이 보충제으로 결함을 구출하기에 충분하다PUFA가 결핍 된 돌연변이 체의 TS. 대부분 지방산 보충제 그러나 특정 오메가 -6 지방산, 특히 디 호모-γ 리놀렌산 (DGLA, 20시 3분 N-6) C.의 영구 파괴 원인을 야생형 동물에 아무런 악영향이 없다 엘레 배아 세포 7,8.
기체 크로마토 그래피는 세균성 음식 소스 (OP50 HT115 또는 하나)에서뿐만 아니라, 선충의 보충 지방산의 흡수를 모니터링하기 위해 사용된다. 미디어 세제 TERGITOL (NP-40)의 첨가는 전체 플레이트와 E. 의한 지방산의 더 효율적인 흡수를 통한 지방산의 균일 한 분포를 허용 대장균 및 선충. 우리는 불포화 지방산이 쉽게 박테리아와 C.에 의해 흡수되는 것을 발견했다 엘레 있지만, 포화 지방산의 흡수는 훨씬 덜 효율적이다. 이 문서에서는 지방산과 한천 매체를 보완하는 방법을 단계별로 설명합니다,뿐만 아니라 일의 지방산 흡수를 모니터링하는 방법과 같은 것가스 크로마토 그래피를 사용하여 전자 선충.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 C의 보충하는 방법을 설명 식이 불포화 지방산의 elegans. 위에서 언급 한 바와 같이 된 PUFA의 이중 결합의 반응 특성이 지방산은 열과 빛 (11)을 통해 산화에 민감하게 반응하는 원인이되기 때문에주의를 PUFA 보충 판의 제조에주의해야합니다. 산화를 방지하기 위해, 용지가 어두운 환경에서 55 ° C 저장 플레이트로 냉각되면, 액체 한천 배지에 PUFA을 추가하는 것…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 원고에 도움이 코멘트 대표 결과 그림 3과 제이슨 와츠와 크리스 웹스터에 표시된 예비 실험을 수행하기 위해 크리스 웹스터 감사합니다. 이 연구를위한 자금 조달은 JLW에 건강의 국립 연구소 (미국) (R01DK074114)에서 교부금에 의해 제공되었다. 이 작품에 사용 된 일부 선충 균주 연구 인프라 프로그램의 NIH 사무소 (P40의 OD010440)에 의해 재정 지원 Caenorhabditis의 유전학 센터에 의해 제공되었다.
Materials
| Bacto-Agar | Difco | 214010 | |
| Tryptone | Difco | 211705 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624-05 | |
| Tergitol | Sigma | NP40S-500mL | |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | (5 mg/mL in ethanol) |
| MgSO4 | J.T. Baker | 2504-01 | |
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3254-05 | |
| KH2PO4 | J.T. Baker | 3246-05 | |
| Sodium dihomogamma linolenate | NuCHEK | S-1143 | |
| Warm sterile Millipore water | |||
| Sterile water for collecting worms | |||
| Nuclease-free Water for DGLA stock solution | Ambion | AM9932 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | 100 mg/ml in water (for RNAi plates) |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Gold Biotechnology | 12481C100 | 1 M in water (for RNAi plates) |
| HSO4 | J.T. Baker | 9681-03 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Hexane | Fisher Scientific | H302-4 | |
| diamindinophenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| VectaShield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Glass Flask | Corning | 4980-2L | |
| Autoclaveable Glass bottles with stirbars | Fisherbrand | FB-800 | |
| Autoclaveable Glass Graduated Cylinder | Fisherbrand | 08-557 | |
| Stir Plate | VWR | 97042-642 | |
| Waterbath at 55+ °C | Precision Scientific Inc. | 66551 | |
| Screwcap Brown Glass Vial | Sun SRI | 200 494 | |
| Argon gas tank | |||
| Automated Pipette aid | Pipette-Aid | P-90297 | |
| Sterile Serological Pipettes (25 ml) | Corning | 4489 | |
| Bunsen Burner | VWR | 89038-534 | |
| Dissection microscope | Leica | TLB3000 | |
| Silanized glass tube | Thermo Scientific | STT-13100-S | for FAMEs derivitization |
| PTFE Screw caps | Kimble-Chase | 1493015D | |
| Clinical tabletop centrifuge | IEC | ||
| GC Crimp Vial | SUN SRi | 200 000 | |
| GC Vial Insert | SUN SRi | 200 232 | |
| GC Vial cap | SUN SRi | 200 100 | |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890A | |
| Mass Spectrometry Detector | Agilent | 5975C | |
| Column for gas chromatography | Suppelco | SP 2380 | 30 m x 0.25 mm fused silica capillary column |
References
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