In vivo Postnatale Elektroporatie en time-lapse imaging van neuroblast Migratie in Muis Acute Brain Slices
Summary
Neuroblast migratie is een fundamentele gebeurtenis in postnatale neurogenese. We beschrijven een protocol voor efficiëntie-etikettering van neuroblasts door in vivo postnatale elektroporatie en de daaropvolgende visualisatie van hun migratie met behulp van time-lapse imaging van acute hersenen plakjes. Wij beschikken over een beschrijving van de kwantitatieve analyse van neuroblast dynamiek door video-tracking.
Abstract
Subventriculaire zone (SVZ) is een van de belangrijkste neurogene niches in de postnatale hersenen. Hier, neurale voorlopercellen vermenigvuldigen en aanleiding geven tot neuroblasts staat langs de rostrale migratie stroom (RMS) te verplaatsen naar de bulbus olfactorius (OB). Deze lange-afstand migratie vereist voor de daaropvolgende rijping van pasgeboren neuronen in de OB, maar de moleculaire mechanismen reguleren deze taak zijn nog onduidelijk. Het onderzoeken van de signaalwegen leidend neuroblast beweeglijkheid kan niet alleen helpen begrijpen een fundamentele stap in neurogenese, maar ook therapeutisch regeneratief potentieel, gezien het vermogen van deze neuroblasts hersenen plaatsen aangetast door verwonding, beroerte, of degeneratie richten.
In dit manuscript beschrijven we een gedetailleerd protocol voor in vivo postnatale elektroporatie en de daaropvolgende time-lapse imaging van neuroblast migratie in de muis RMS. Postnatale elektroporatie kan efficiënt transfecteren SVZ voorlopercellencellen, die op hun beurt neuroblasts migreren langs de RMS. Met behulp van confocale draaiende schijf time-lapse microscopie op acute hersenen slice culturen, kan neuroblast migratie worden bewaakt in een omgeving die gelijkenis vertonen met de in vivo toestand. Bovendien kan neuroblast beweeglijkheid worden gevolgd en kwantitatief geanalyseerd. Als voorbeeld beschrijven we hoe in vivo postnatale elektroporatie van een GFP-expressie plasmide gebruiken labelen en visualiseren neuroblasts migreren langs de RMS. Elektroporatie van shRNA of CRE-recombinase tot expressie plasmiden conditionele knockout muizen onder toepassing van de LoxP systeem kan ook worden gebruikt om genen van belang richten. Farmacologische manipulatie van acute hersenen slice culturen kunnen worden uitgevoerd om de rol van verschillende signaalmoleculen in neuroblast migratie te onderzoeken. Door de koppeling van in vivo elektroporatie met time-lapse imaging, hopen we de moleculaire mechanismen die neuroblast beweeglijkheid te begrijpen en bij te dragen tot de ontwikkeling vanling van nieuwe benaderingen herstelmechanismen in de hersenen te bevorderen.
Introduction
In de hersenen van zoogdieren, de generatie van nieuwe neuronen (neurogenese) plaatsvindt na de geboorte voornamelijk in twee gebieden, de subventriculaire zone (SVZ) van de laterale ventrikels en de subgranulaire zone in de dentate gyrus van de hippocampus 1. Verzameld in de afgelopen jaren aanzienlijk bewijs ondersteunt een cruciale rol voor postnatale neurogenese in de hippocampus en het reukorgaan geheugenfuncties 1-3. Belangrijk postnatale neurogenese heeft ook therapeutisch potentieel vanwege de relatie met degeneratieve neurologische aandoeningen, en het vermogen van neuroblasts te migreren naar gewonde gebieden in de hersenen 4-6.
Subventriculaire zone (SVZ) is onlangs naar voren gekomen als een cruciale neurogene niche. SVZ-afgeleide neuroblasts migreren naar de bulbus olfactorius (OB) via de rostrale migratie stroom (RMS), waardoor dit de langste migratieproces in de postnatale hersenen 1,7,8. De zoogdieren SVZ / RMS / OB systeem is uitgegroeid tot eenbruikbaar model voor verschillende stappen in neurogenese, bijvoorbeeld proliferatie, migratie en differentiatie 1,8 bestuderen. Veel groeifactoren en extracellulaire signalen reguleren SVZ neurogenese en migratie langs de RMS, maar de intracellulaire moleculaire mechanismen lang niet volledig begrepen 1,9. Juiste migratie langs de RMS is cruciaal voor de verdere rijping van pasgeboren neuronen 10. Daarnaast hebben sommige studies aangetoond dat SVZ-afgeleide neuroblasts kunnen migreren uit de RMS om hersenletsel locaties 4-6,11-13. Zo onderzoekt de signalerende mechanismen betrokken neuroblast migratie is niet alleen essentieel om neurogenese te begrijpen, maar ook voor potentiële therapeutische toepassingen.
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor SVZ neurale voorlopercellen labelen door in vivo postnatale elektroporatie en het toezicht op hun migratie langs de RMS in acute hersenen slice culturen met behulp van time-lapse draaiende schijf confocale microscopy. Elektroporatie wordt veel gebruikt in de ontwikkelings-studies uit embryonale naar volwassen stadia 14-18. Het is een krachtig hulpmiddel te richten en te manipuleren SVZ neurale voorlopercellen en vertegenwoordigt een aanzienlijk goedkoper en sneller alternatief stereotactische injectie van virale vectoren of genereren van transgene modellen 1,15,19,20. Het is een relatief eenvoudige procedure die geen chirurgie nodig en heeft een hoge overleving. Elektroporatie van shRNA of CRE-recombinase tot expressie plasmiden muizen genetische modellen gebruik van de LoxP systeem worden gebruikt om genen van belang richten of permanente etikettering van SVZ voorlopers bereiken, zodat aan een nuttig instrument voor volwassen neurogenese studies 21,22.
Imaging RMS neuroblast migratie in de intacte hersenen is nog steeds een uitdaging te wijten aan de huidige technische beperkingen. Echter, dit proces kan worden gecontroleerd met behulp van confocale draaiende schijf time-lapse microscopie van acute hersenen plakjes, die een geschikte syst biedenem gelijkenis vertonen met de in vivo toestand ook vatbaar zijn voor farmacologische manipulatie 23,24. Koppeling in vivo postnatale elektroporatie met time-lapse imaging zal het begrip van de moleculaire mechanismen die neuroblast beweeglijkheid vergemakkelijken en bijdragen tot de ontwikkeling van nieuwe benaderingen om de hersenen te repareren te promoten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Efficiënte migratie van neurale voorlopercellen langs de RMS verzekert de latere rijping in functionele neuronen 10. Prominente stromen van neurale voorlopercellen gericht de OB zijn zichtbaar in menselijke kinderschoenen en waarschijnlijk een belangrijke rol spelen in de vroege postnatale ontwikkeling hersenen 27. Bovendien zijn deze cellen kunnen gebieden van de hersenen getroffen door verwonding en neurodegeneratie 4,28 richten. In staat zijn om in real time het effect van genetische…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MS en YZ worden ondersteund door KCL en KCL-China PhD-training. MO werd gefinancierd door een biotechnologie en biologische wetenschappen Research Council PhD studententijd. Wij danken Masaru Okabe en Jun-ichi Miyazaki voor de PCX-EGFP plasmide en Alain Chedotal en Athena Ypsilanti voor waardevolle adviezen over elektroporatie.
Materials
| Millicell | Millipore | PICM0RG50 | |
| 35 mm Glass bottom culture dish | MatTek | P35G-0-14-C | |
| Gey's Balanced media | Sigma | G9779-500ML | |
| Glucose, 45% | Sigma | G8769-100ML | |
| HEPES | Sigma | H3375-25G | |
| Pen/Strep | GIBCO | 15140-122 | |
| FCS | GIBCO | 10109-163 | |
| B27 supplement | Invitrogen Life Technologies | 17504044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen Life Technologies | 25030-081 | |
| DMEM (phenol red-free) | GIBCO | 31053-028 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Glass capillaries for injection | Harvard Apparatus | 30-0057 | |
| Aspirator tube | Sigma | A5177 | |
| Sutter P-97 capillary puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Platinum Tweezertrodes 7 mm | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Footswitch Model 1250F | Harvard Apparatus | 45-0211 | |
| Gel for electrodes | Cefar Compex | 6602048 | |
| Isoflurane | Merial | AP/DRUGS/220/96 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Glue | Roti coll | Roti coll 1 | |
| UltraViEW VoX spinning disk system | Perkin Elmer | Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Acquisition, Quantitation, Visualization Modules | |
| Environmental chamber for microscopy | Solent Scientific | Custom-made | |
| Ti-E inverted microscope | Nikon | CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper |
References
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
- Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and. 11, 339-350 (2010).
- Lazarini, F., Lledo, P. M. Is adult neurogenesis essential for olfaction?. Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).
- Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat. Med. 8, 963-970 (2002).
- Emsley, J. G., Hagg, T. alpha6beta1 integrin directs migration of neuronal precursors in adult mouse forebrain. Exp. Neurol. 183, 273-285 (2003).
- Sundholm-Peters, N. L., Yang, H. K., Goings, G. E., Walker, A. S., Szele, F. G. Subventricular zone neuroblasts emigrate toward cortical lesions. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 1089-1100 (2005).
- Doetsch, F., Alvarez-Buylla, A. Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 14895-14900 (1996).
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).
- Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis. Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).
- Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. Abnormal neuronal migration changes the fate of developing neurons in the postnatal olfactory bulb. J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).
- Gotts, J. E., Chesselet, M. F. Mechanisms of subventricular zone expansion after focal cortical ischemic injury. J. Comp. Neurol. 488, 201-214 (2005).
- Goings, G. E., Sahni, V., Szele, F. G. Migration patterns of subventricular zone cells in adult mice change after cerebral cortex injury. Brain Res. 996, 213-226 (2004).
- Romanko, M. J., et al. Roles of the mammalian subventricular zone in cell replacement after brain injury. Prog. Neurobiol. 74, 77-99 (2004).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS One. 3, e1883 (2008).
- Barnabe-Heider, F., et al. Genetic manipulation of adult mouse neurogenic niches by in vivo electroporation. Nat. Methods. 5, 189-196 (2008).
- Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Pathania, M., et al. miR-132 enhances dendritic morphogenesis, spine density, synaptic integration, and survival of newborn olfactory bulb neurons. PloS One. 7, e38174 (2012).
- dal Maschio, M., M, , et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nat. Commun. 3, 960 (2012).
- Oudin, M. J., et al. Endocannabinoids regulate the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 31, 4000-4011 (2011).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Front. Neurosci. 4, (2010).
- Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. Neonatal subventricular zone electroporation. J. Vis. Exp. (72), e50197 (2013).
- Nam, S. C., et al. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- James, R., Kim, Y., Hockberger, P. E., Szele, F. G. Subventricular zone cell migration: lessons from quantitative two-photon microscopy. Front. Neurosci. 5, 30 (2011).
- Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Dev. 6, 13 (2011).
- Saha, B., Ypsilanti, A. R., Boutin, C., Cremer, H., Chedotal, A. Plexin-b2 regulates the proliferation and migration of neuroblasts in the postnatal and adult subventricular zone. J. Neurosci. 32, 16892-16905 (2012).
- Sanai, N., et al. Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy. Nature. 478, 382-386 (2011).
- Tattersfield, A. S., et al. Neurogenesis in the striatum of the quinolinic acid lesion model of Huntington’s disease. Neuroscience. 127, 319-332 (2004).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Lledo, P. M., Alonso, M., Grubb, M. S. Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).
- Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Time-lapse imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain. J. Vis. Exp. (67), e4061 (2012).
- Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone. J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).
- Schaar, B. T., McConnell, S. K. Cytoskeletal coordination during neuronal migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 13652-13657 (2005).
- Valiente, M., Marin, O. Neuronal migration mechanisms in development and disease. Curr.Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).
- Comte, I., et al. Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb. J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).
- Sonego, M., et al. Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).
