In vivo electroporation ואחרי הלידה וזמן לשגות הדמיה של neuroblast הגירה בעכבר חריפה פרוסות המוח
Summary
הגירת neuroblast היא אירוע מהותי בנוירוגנזה לאחר לידה. אנו מתארים פרוטוקול תיוג יעיל של neuroblasts ידי in vivo electroporation לאחר לידה ולאחר מכן להדמיה של ההגירה שלהם באמצעות זמן לשגות הדמיה של פרוסות מוח חריפות. אנו כוללים תיאור לניתוח כמותי של דינמיקת neuroblast ידי מעקב וידאו.
Abstract
אזור subventricular (SVZ) הוא אחת מהנישות העצביות העיקריות במוח לאחר הלידה. כאן, אבות עצביים להתרבות ולהצמיח neuroblasts מסוגל לנוע לאורך הנחל מקורי נודד (RMS) לכיוון הנורה חוש הריח (OB). נדידה למרחקים ארוכים זו נדרשת להבשלה המאוחרת של נוירונים יילוד בOB, אבל המנגנונים המולקולריים המסדירים את התהליך הזה עדיין אינם ברורים. חוקר את מסלולי איתות שליטה תנועתיות neuroblast יכול לא רק לעזור להבין צעד מהותי בנוירוגנזה, אבל יש גם פוטנציאל התחדשות טיפולי, בהתחשב ביכולת של neuroblasts אלה כדי למקד לאתרים במוח מושפעים מפציעה, שבץ מוחי או ניוון.
בכתב היד הזה אנו מתארים פרוטוקול מפורט לin vivo electroporation לאחר הלידה והזמן לשגות ההדמיה הבאה של הגירת neuroblast בRMS העכבר. electroporation אחרי הלידה יכול ביעילות transfect אב SVZתאים, אשר בתורו ליצור neuroblasts נודד לאורך RMS. באמצעות confocal ספינינג מיקרוסקופיה זמן לשגות דיסק בתרבויות פרוסה מוח חריפים, הגירת neuroblast ניתן לנטר בסביבה הדומה למצב in vivo בשיתוף פעולה הדוק. יתר על כן, תנועתיות neuroblast יכולות להיות במעקב וכמותית מנותחת. כדוגמא, אנו מתארים כיצד להשתמש בvivo electroporation לאחר הלידה של פלסמיד-GFP-לבטא לתייג ולדמיין neuroblasts נודד לאורך RMS. גם electroporation של פלסמידים-להביע recombinase shRNA או CRE בעכברים בנוקאאוט מותנים העסקת מערכת LoxP יכול לשמש יעד הגנים של עניין. מניפולציה תרופתית של תרבויות פרוסה מוח חריפות ניתן לבצע כדי לחקור את התפקיד של מולקולות איתות שונות בהגירה neuroblast. על ידי צימוד ב electroporation vivo עם הזמן לשגות הדמיה, אנו מקווים להבין את המנגנונים המולקולריים שליטה תנועתיות neuroblast ולתרום לפיתוחment של גישות חדשות כדי לקדם את תיקון מוח.
Introduction
במוח של היונקים, הדור של נוירונים חדשים (נוירוגנזה) מתרחש לאחר לידה בעיקר בשני אזורים, אזור subventricular (SVZ) של החדרים לרוחב ואזור subgranular ברכס משוננת של ההיפוקמפוס 1. ראיות רבות שנאספו בשנים האחרונות תומכת בתפקיד קריטי לנוירוגנזה לאחר לידה בתפקודי זיכרון הנורה בהיפוקמפוס וחוש ריח 1-3. חשוב לציין, נוירוגנזה לאחר הלידה גם בעל פוטנציאל טיפולי בגלל מערכת היחסים שלה עם הפרעות נוירולוגיות ניווניות, ואת היכולת של neuroblasts להגר לאתרים פגועים במוח 4-6.
אזור subventricular (SVZ) התפתחה לאחרונה כנישת נוירוגנית מכרעת. neuroblasts נגזרת SVZ נודדות לכיוון הנורה חוש הריח (OB) דרך הזרם מקורי נודד (RMS), מה שהופך את זה לתהליך ההגירה הארוך ביותר ב1,7,8 המוח לאחר הלידה. / RMS / מערכת OB היונקים SVZ הפכהמודל שימושי ללמוד צעדים שונים בנוירוגנזה, כגון התפשטות, הגירה ו1,8 בידול. גורמי גדילה רבים ורמזים תאיים להסדיר נוירוגנזה SVZ והגירה לאורך RMS, אבל המנגנונים המולקולריים תאיים רחוקים מלהיות באופן מלא הבינו 1,9. הגירה נכונה לאורך RMS היא קריטית להבשלה המאוחרת של נוירונים יילוד 10. בנוסף, חלק מהמחקרים הראו כי neuroblasts נגזרת SVZ יכולה להעביר מתוך RMS לאתרי פגיעה מוחית 4-6,11-13. לכן, חוקר את נדידת neuroblast ויסות מנגנוני איתות הוא יסוד לא רק להבין נוירוגנזה אלא גם ליישומים טיפוליים פוטנציאליים.
כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לתייג אבות עצביים SVZ ידי in vivo electroporation לאחר הלידה ולעקוב אחר הנדידה שלהם לאורך RMS בתרבויות פרוס מוח חריפות באמצעות microsco confocal הדיסק מסתובב זמן לשגותpy. Electroporation נעשה שימוש נרחב במחקרים התפתחותיים מעובריים לשלבים בוגרים 14-18. זהו כלים רבי עוצמה כדי לכוון ולתפעל אבות עצביים SVZ ומהווה חלופה זולה יותר והרבה יותר מהר להזרקת stereotactic של וקטורים או דור ויראלי של מודלים מהונדסים 1,15,19,20. זהו הליך פשוט יחסית, שאינו זקוק לניתוח ויש לו שיעורי הישרדות גבוהים. Electroporation של shRNA או פלסמידים-להביע recombinase CRE במודלים גנטיים עכבר העסקת מערכת LoxP יכול לשמש יעד גנים של עניין או להשיג תיוג קבוע של אבות SVZ, ובכך מייצג את כלי שימושי ללימודי neurogenesis למבוגרים 21,22.
הגירת neuroblast RMS הדמיה במוח השלמה היא עדיין מאתגרת בשל מגבלות טכניות הנוכחיות. עם זאת, ניתן לנטר את התהליך הזה באמצעות מיקרוסקופיה זמן לשגות ספינינג confocal דיסק של פרוסות מוח חריפות, המספקות syst מתאיםשלהם דומים מאוד מצב in vivo גם נתונים למניפולציה תרופתית 23,24. הצימוד ב electroporation vivo לאחר הלידה עם הזמן לשגות הדמיה יקל על ההבנה של המנגנונים המולקולריים שליטה תנועתיות neuroblast ולתרום לפיתוח גישות חדשות כדי לקדם את תיקון מוח.
Protocol
Representative Results
Discussion
הגירה יעילה של אבות עצביים לאורך RMS מבטיחה ההתבגרות הבאה שלהם לתוך הנוירונים פונקציונליים 10. בולטים זרמים של אבות עצביים מכוונים OB גלויים בינקות אדם ועשויים לשחק תפקיד חשוב בהתפתחות המוח האנושי לאחר לידה המוקדמת 27. יתר על כן, תאים אלה מסוגלים למקד לאתרים ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
טרשת נפוצה וYZ נתמכים על ידי studentships PhD KCL וKCL-סין. MO מומן על ידי מלגת לימודי דוקטורט ביוטכנולוגיה ומחקר מדעי הביולוגיה מועצה. אנו מודים מאסארו Okabe ויוני ichi מיאזאקי לפלסמיד PCX-EGFP ואלן Chedotal ויתנה Ypsilanti לייעוץ רב ערך על electroporation.
Materials
| Millicell | Millipore | PICM0RG50 | |
| 35 mm Glass bottom culture dish | MatTek | P35G-0-14-C | |
| Gey's Balanced media | Sigma | G9779-500ML | |
| Glucose, 45% | Sigma | G8769-100ML | |
| HEPES | Sigma | H3375-25G | |
| Pen/Strep | GIBCO | 15140-122 | |
| FCS | GIBCO | 10109-163 | |
| B27 supplement | Invitrogen Life Technologies | 17504044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen Life Technologies | 25030-081 | |
| DMEM (phenol red-free) | GIBCO | 31053-028 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Glass capillaries for injection | Harvard Apparatus | 30-0057 | |
| Aspirator tube | Sigma | A5177 | |
| Sutter P-97 capillary puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Platinum Tweezertrodes 7 mm | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Footswitch Model 1250F | Harvard Apparatus | 45-0211 | |
| Gel for electrodes | Cefar Compex | 6602048 | |
| Isoflurane | Merial | AP/DRUGS/220/96 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Glue | Roti coll | Roti coll 1 | |
| UltraViEW VoX spinning disk system | Perkin Elmer | Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Acquisition, Quantitation, Visualization Modules | |
| Environmental chamber for microscopy | Solent Scientific | Custom-made | |
| Ti-E inverted microscope | Nikon | CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper |
References
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
- Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and. 11, 339-350 (2010).
- Lazarini, F., Lledo, P. M. Is adult neurogenesis essential for olfaction?. Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).
- Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat. Med. 8, 963-970 (2002).
- Emsley, J. G., Hagg, T. alpha6beta1 integrin directs migration of neuronal precursors in adult mouse forebrain. Exp. Neurol. 183, 273-285 (2003).
- Sundholm-Peters, N. L., Yang, H. K., Goings, G. E., Walker, A. S., Szele, F. G. Subventricular zone neuroblasts emigrate toward cortical lesions. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 1089-1100 (2005).
- Doetsch, F., Alvarez-Buylla, A. Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 14895-14900 (1996).
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).
- Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis. Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).
- Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. Abnormal neuronal migration changes the fate of developing neurons in the postnatal olfactory bulb. J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).
- Gotts, J. E., Chesselet, M. F. Mechanisms of subventricular zone expansion after focal cortical ischemic injury. J. Comp. Neurol. 488, 201-214 (2005).
- Goings, G. E., Sahni, V., Szele, F. G. Migration patterns of subventricular zone cells in adult mice change after cerebral cortex injury. Brain Res. 996, 213-226 (2004).
- Romanko, M. J., et al. Roles of the mammalian subventricular zone in cell replacement after brain injury. Prog. Neurobiol. 74, 77-99 (2004).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS One. 3, e1883 (2008).
- Barnabe-Heider, F., et al. Genetic manipulation of adult mouse neurogenic niches by in vivo electroporation. Nat. Methods. 5, 189-196 (2008).
- Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Pathania, M., et al. miR-132 enhances dendritic morphogenesis, spine density, synaptic integration, and survival of newborn olfactory bulb neurons. PloS One. 7, e38174 (2012).
- dal Maschio, M., M, , et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nat. Commun. 3, 960 (2012).
- Oudin, M. J., et al. Endocannabinoids regulate the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 31, 4000-4011 (2011).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Front. Neurosci. 4, (2010).
- Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. Neonatal subventricular zone electroporation. J. Vis. Exp. (72), e50197 (2013).
- Nam, S. C., et al. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- James, R., Kim, Y., Hockberger, P. E., Szele, F. G. Subventricular zone cell migration: lessons from quantitative two-photon microscopy. Front. Neurosci. 5, 30 (2011).
- Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Dev. 6, 13 (2011).
- Saha, B., Ypsilanti, A. R., Boutin, C., Cremer, H., Chedotal, A. Plexin-b2 regulates the proliferation and migration of neuroblasts in the postnatal and adult subventricular zone. J. Neurosci. 32, 16892-16905 (2012).
- Sanai, N., et al. Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy. Nature. 478, 382-386 (2011).
- Tattersfield, A. S., et al. Neurogenesis in the striatum of the quinolinic acid lesion model of Huntington’s disease. Neuroscience. 127, 319-332 (2004).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Lledo, P. M., Alonso, M., Grubb, M. S. Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).
- Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Time-lapse imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain. J. Vis. Exp. (67), e4061 (2012).
- Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone. J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).
- Schaar, B. T., McConnell, S. K. Cytoskeletal coordination during neuronal migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 13652-13657 (2005).
- Valiente, M., Marin, O. Neuronal migration mechanisms in development and disease. Curr.Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).
- Comte, I., et al. Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb. J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).
- Sonego, M., et al. Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).
