Summary

In-vivo-Elektroporation und Postnatale Zeitraffer-Imaging Neuroblast von Migration in Maus Akute Hirnschnitten

Published: November 25, 2013
doi:

Summary

Neuroblast Migration ist ein grundlegendes Ereignis in der postnatalen Neurogenese. Wir beschreiben ein Protokoll für die effiziente Markierung von Neuroblasten durch in vivo Elektroporation postnatalen und anschließende Visualisierung der Migration mit Zeitraffer-Bildgebung der akuten Hirnschnitten. Wir sind eine Beschreibung für die quantitative Analyse von Neuroblast Dynamik von Video-Tracking.

Abstract

Die Subventrikularzone (SVZ) ist einer der wichtigsten neurogenen Nischen in der postnatalen Gehirn. Hier neuralen Vorläuferzellen vermehren sich und führen zu Neuroblasten in der Lage, entlang des rostralen Migrationsstrom (RMS) zum Bulbus olfactorius (OB) zu bewegen. Diese Fern Migration für die anschließende Reifung neugeborener Neuronen im OB benötigt, aber die molekulare Mechanismen, die diesen Prozess sind noch unklar. Untersuchung der Signalwege steuern Neuroblast Motilität kann nicht nur helfen, zu verstehen, einen entscheidenden Schritt in der Neurogenese, sondern auch therapeutische regenerative Potenzial, da die Fähigkeit der Neuroblasten zu Hirn Websites durch Verletzung, Schlaganfall oder Degeneration betroffen Ziel.

In dieser Handschrift beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für in vivo-Elektroporation und anschließender postnatale Zeitraffer-Bildgebung Neuroblast von Migration in den Maus RMS. Postnatale Elektroporation kann SVZ Vorläufer effizient transfizierenZellen, die wiederum erzeugen Neuroblasten Migration entlang der RMS. Mit der konfokalen Spinning-Disk-Zeitraffer-Mikroskopie an akuten Hirnschnittkulturen, können Neuroblast Migration in einer Umgebung, sehr ähnlich der in vivo-Zustand überwacht werden. Außerdem kann Neuroblasten Motilität verfolgt und quantitativ analysiert werden. Als Beispiel beschreiben wir, wie man in vivo Elektroporation postnatale einer GFP-exprimierenden Plasmid verwenden, um zu kennzeichnen und zu visualisieren Neuroblasten Migration entlang der RMS. Elektroporation von shRNA oder CRE-Rekombinase-exprimierenden Plasmiden in Knockout-Mäusen unter Verwendung der loxP-System kann auch verwendet werden, um Gene von Interesse abzuzielen. Pharmakologische Manipulation von akuten Hirnschnittkulturen durchgeführt werden, um die Rolle der verschiedenen Signalmoleküle in Neuroblasten Migration zu untersuchen. Durch die Kopplung von In-vivo-Elektroporation mit Zeitraffer-Bildgebung, hoffen wir, die molekularen Mechanismen, die die Neuroblast Motilität verstehen und dazu beitragen, die Entwicklunglung neuer Ansätze zur Heilung des Gehirns zu fördern.

Introduction

Im Säugerhirn, die Erzeugung von neuen Neuronen (Neurogenese) erfolgt nach der Geburt vor allem in zwei Regionen, die Subventrikularzone (SVZ) der Seitenventrikel und der Subgranularzone im Gyrus dentatus des Hippocampus 1. Deutliche Beweise in den letzten Jahren gesammelt unterstützt eine entscheidende Rolle für die postnatalen Neurogenese im Hippocampus und Riechkolben Speicherfunktionen 1-3. Wichtig ist, daß die postnatale Neurogenese auch therapeutisches Potential aufgrund der Beziehung mit degenerativen neurologischen Störungen, und die Fähigkeit von Neuroblasten an verletzten Stellen im Gehirn 4-6 migrieren.

Die Subventrikularzone (SVZ) hat vor kurzem als ein entscheidender neurogenen Nische. SVZ abgeleiteten Neuroblasten wandern zur Riechkolben (OB) über dem rostralen Migrationsstrom (Effektivwert), so dass dies die längste Migration in der postnatalen Gehirn 1,7,8. Die Säugetier SVZ / RMS / OB-System hat sich zu einemnützliches Modell, um verschiedene Schritte der Neurogenese, wie Proliferation, Migration und Differenzierung 1,8 studieren. Viele Wachstumsfaktoren und extrazelluläre Signale regulieren SVZ Neurogenese und Migration entlang der RMS, aber die intrazellulären molekularen Mechanismen sind bei weitem nicht vollständig verstanden 1,9. Proper Migration entlang der RMS ist entscheidend für die spätere Reifung neugeborener Neuronen 10. Darüber hinaus haben einige Studien gezeigt, dass SVZ-derived Neuroblasten kann der RMS-Hirn-Verletzungen Websites 4-6,11-13 migrieren. So untersucht die Signalmechanismen Regelneuroblast Migration ist von grundlegender Bedeutung nicht nur für die Neurogenese zu verstehen, sondern auch für mögliche therapeutische Anwendungen.

Hier ein ausführliches Protokoll zu SVZ neuralen Vorläuferzellen durch in vivo Elektroporation postnatale beschriften und Überwachung ihrer Wanderung entlang der RMS in akuten Hirnschnittkulturen mit Zeitraffer-konfokale Mikroskopie drehenden Scheibe beschreiben wirpy. Elektroporation ist weit verbreitet in Entwicklungsstudien aus embryonalen zu adulten Stadien 14-18 verwendet. Es ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um gezielt manipulieren SVZ neuralen Vorläuferzellen und ist ein kostengünstiger und wesentlich schnellere Alternative zu stereotaktische Injektion von viralen Vektoren oder Erzeugung transgener Modelle 1,15,19,20. Es ist ein relativ einfaches Verfahren, das nicht braucht, Chirurgie und hat eine hohe Überlebensraten. Elektroporation von shRNA oder CRE-Rekombinase-exprimierenden Plasmiden in Maus-Modellen Verwendung der genetischen LoxP System kann verwendet werden, um gezielt Gene von Interesse oder dauerhafte Kennzeichnung von SVZ Vorläuferzellen zu erreichen, stellt somit ein nützliches Werkzeug für die adulte Neurogenese Studien 21,22 werden.

RMS Imaging Neuroblast Migration im intakten Gehirn ist immer noch eine Herausforderung aufgrund der aktuellen technischen Einschränkungen. Allerdings kann dieser Prozess mit Hilfe der konfokalen Spinning-Disk-Zeitraffer-Mikroskopie von akuten Hirnschnitten, die eine geeignete syst bieten überwacht werdenem sehr ähnlich der in vivo-Zustand, der auch offen für pharmakologische Manipulation 23,24. Kopplung in vivo Elektroporation mit postnatalen Zeitraffer-Imaging wird das Verständnis der molekularen Mechanismen, die die Neuroblast Beweglichkeit erleichtern und dazu beitragen, die Entwicklung von neuartigen Ansätzen zur Heilung des Gehirns zu fördern.

Protocol

Dieses Verfahren steht im Einklang mit den britischen Home Office Verordnungen (Tier Scientific Procedures Act, 1986). Wissenschaftler sollten die etablierten und durch ihre institutionelle und nationale Regulierungsorganisationen Tier genehmigten Richtlinien zu folgen. 1. Postnatale Elektroporation 1.1. Herstellung von Glas-Kapillaren, DNA-Lösung und Electroporator Bereiten zogene Glaskapillaren (OD: 1,5 mm, ID: 0,86 mm) für die DNA-Injektion. (Richt E…

Representative Results

Kennzeichnung von SVZ-abgeleiteten Migrationsneuroblasten entlang der RMS beobachtet werden, in der Regel 4-8 Tage nach einer erfolgreichen Elektroporation (Abbildung 1B). Längere Zeitpunkte können auch gewählt werden, weniger Zellen werden in den RMS gefunden werden, da die meisten von ihnen die OB eingegeben. Neuroblasten starten Erwerb typische Morphologie und Eigenschaften von reifen Körnerzellen im OB etwa 2-3 Wochen nach der Elektroporation (nicht gezeigt). Nach Kultivierung für ~ 1 Stunde, k…

Discussion

Effiziente Migration von neuralen Vorläuferzellen entlang der RMS sorgt für deren anschließende Reifung in funktionelle Neuronen 10. Prominent Streams von neuralen Vorläuferzellen in Richtung des OB gerichtet sind, sind in der menschlichen Kindheit sichtbar und werden wahrscheinlich eine wichtige Rolle in der frühen postnatalen Entwicklung des menschlichen Gehirns 27 zu spielen. Darüber hinaus sind diese Zellen in der Lage, Websites des Gehirns durch Verletzungen und Neurodegeneration betroff…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

MS und YZ werden von KCL KCL-und PhD student China unterstützt. MO wurde von einem Biotechnologie und Biologische Wissenschaften Research Council Doktoranden-Stipendium gefördert. Wir danken Masaru Okabe und Jun-ichi Miyazaki für die pCX-EGFP-Plasmid und Alain Chedotal und Athena Ypsilanti für wertvolle Erfahrungsberichte Elektroporation.

Materials

Millicell Millipore PICM0RG50
35 mm Glass bottom culture dish MatTek P35G-0-14-C
Gey's Balanced media Sigma G9779-500ML
Glucose, 45% Sigma G8769-100ML
HEPES Sigma H3375-25G
Pen/Strep GIBCO 15140-122
FCS GIBCO 10109-163
B27 supplement Invitrogen Life Technologies 17504044
L-Glutamine Invitrogen Life Technologies 25030-081
DMEM (phenol red-free) GIBCO 31053-028
Fast Green Sigma F7252-5G
Glass capillaries for injection Harvard Apparatus 30-0057
Aspirator tube Sigma A5177
Sutter P-97 capillary puller Sutter Instrument P-97
ECM830 Square Wave Electroporator Harvard Apparatus 45-0052
Platinum Tweezertrodes 7 mm Harvard Apparatus 45-0488
Footswitch Model 1250F Harvard Apparatus 45-0211
Gel for electrodes Cefar Compex 6602048
Isoflurane Merial AP/DRUGS/220/96
Vibratome Leica VT1000S
Glue Roti coll Roti coll 1
UltraViEW VoX spinning disk system Perkin Elmer Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera
Volocity software Perkin Elmer Acquisition, Quantitation, Visualization Modules
Environmental chamber for microscopy Solent Scientific Custom-made
Ti-E inverted microscope Nikon CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper

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Sonego, M., Zhou, Y., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices. J. Vis. Exp. (81), e50905, doi:10.3791/50905 (2013).

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