माउस तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें में Neuroblast प्रवासन के विवो प्रसव के बाद electroporation में और समय चूक इमेजिंग
Summary
Neuroblast प्रवास प्रसवोत्तर neurogenesis में एक मौलिक घटना है. हम तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें के समय चूक इमेजिंग का उपयोग vivo में प्रसव के बाद electroporation और उनके प्रवास के बाद के दृश्य द्वारा neuroblasts के कुशल लेबलिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. हम वीडियो पर नज़र रखने के द्वारा Neuroblast गतिशीलता के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक विवरण शामिल हैं.
Abstract
subventricular क्षेत्र (SVZ) प्रसव के बाद मस्तिष्क में मुख्य तंत्रिकाजन्य आलों में से एक है. इधर, तंत्रिका progenitors पैदा करना और घ्राण बल्ब (ओ) की ओर व्याख्यान चबूतरे वाला प्रवासी धारा (आरएमएस) के साथ ले जाने में सक्षम neuroblasts को जन्म दे. यह लंबी दूरी के प्रवास ओबी में नवजात न्यूरॉन्स के बाद परिपक्वता के लिए आवश्यक है, लेकिन इस प्रक्रिया को विनियमित आणविक तंत्र अभी भी स्पष्ट नहीं है. Neuroblast गतिशीलता को नियंत्रित करने के संकेत दे रास्ते की जांच कर neurogenesis में एक बुनियादी कदम को समझने में मदद, लेकिन यह भी चोट, स्ट्रोक, या अध: पतन से प्रभावित मस्तिष्क साइटों को लक्षित करने के लिए इन neuroblasts की क्षमता दे दी, चिकित्सकीय पुनर्योजी क्षमता हो सकती है ही नहीं.
इस पांडुलिपि में हम vivo में प्रसव के बाद electroporation और माउस आरएमएस में Neuroblast प्रवास के बाद के समय चूक इमेजिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन. प्रसव के बाद electroporation कुशलतापूर्वक SVZ पूर्वज transfect कर सकते हैंबदले में आरएमएस साथ पलायन neuroblasts उत्पन्न कोशिकाओं है, जो. तीव्र मस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों पर डिस्क समय चूक माइक्रोस्कोपी कताई confocal का प्रयोग, Neuroblast प्रवास बारीकी में विवो हालत जैसी एक वातावरण में नजर रखी जा सकती है. इसके अलावा, Neuroblast गतिशीलता पर नज़र रखी और मात्रात्मक विश्लेषण किया जा सकता है. एक उदाहरण के रूप में, हम आरएमएस साथ पलायन neuroblasts लेबल और कल्पना करने के लिए एक GFP-व्यक्त प्लाज्मिड के vivo प्रसव के बाद electroporation उपयोग करने के लिए क्या करते हैं. LoxP प्रणाली को रोजगार सशर्त पीटा चूहों में shRNA या Cre recombinase व्यक्त plasmids के electroporation भी ब्याज की जीन लक्ष्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. तीव्र मस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों के औषधीय हेरफेर Neuroblast प्रवास में अलग संकेतन अणुओं की भूमिका की जांच करने के लिए किया जा सकता है. समय चूक इमेजिंग के साथ vivo electroporation में युग्मन, हम Neuroblast गतिशीलता को नियंत्रित आणविक तंत्र को समझने और विकसित करने के लिए योगदान करने की उम्मीद हैउपन्यास के बयान मस्तिष्क की मरम्मत को बढ़ावा देने के दृष्टिकोण.
Introduction
स्तनधारी मस्तिष्क में नए न्यूरॉन्स (न्यूरोजेनेसिस) की पीढ़ी के लिए मुख्य रूप से दो क्षेत्रों में जन्म के बाद होता है, हिप्पोकैम्पस 1 की दांतेदार गाइरस में पार्श्व ventricles और subgranular क्षेत्र के subventricular क्षेत्र (SVZ). हाल के वर्षों में एकत्र हुए काफी सबूत हिप्पोकैम्पस और घ्राण बल्ब स्मृति समारोह 1-3 में प्रसव के बाद neurogenesis के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका का समर्थन करता है. महत्वपूर्ण बात है, प्रसव के बाद न्यूरोजेनेसिस भी चिकित्सकीय क्योंकि अपक्षयी मस्तिष्क संबंधी बीमारियों के साथ अपने संबंधों की क्षमता है, और मस्तिष्क 4-6 में घायल साइटों की ओर पलायन neuroblasts की क्षमता रखती है.
subventricular क्षेत्र (SVZ) ने हाल ही में एक महत्वपूर्ण तंत्रिकाजन्य जगह के रूप में उभरा है. SVZ व्युत्पन्न neuroblasts इस प्रसव के बाद मस्तिष्क 1,7,8 में सबसे लंबे समय तक माइग्रेशन प्रक्रिया बनाने, व्याख्यान चबूतरे वाला प्रवासी धारा (आरएमएस) के माध्यम से घ्राण बल्ब (ओ) की ओर पलायन. स्तनधारी SVZ / आरएमएस / ओ प्रणाली एक बन गया हैइस तरह के प्रसार, प्रवास और भेदभाव 1,8 के रूप में neurogenesis में विभिन्न चरणों का अध्ययन करने के लिए उपयोगी मॉडल. कई वृद्धि कारकों और बाह्य cues आरएमएस साथ SVZ न्यूरोजेनेसिस और प्रवास विनियमित, लेकिन intracellular आणविक तंत्र अब तक पूरी तरह से किया जा रहा से 1,9 समझ में आ रहे हैं. आरएमएस साथ उचित प्रवास नवजात न्यूरॉन्स 10 के बाद परिपक्वता के लिए महत्वपूर्ण है. साथ ही, कुछ अध्ययनों SVZ व्युत्पन्न neuroblasts मस्तिष्क चोट साइटों 4-6,11-13 को आरएमएस के बाहर पलायन कर सकते हैं कि पता चला है. इस प्रकार, संकेतन तंत्र विनियमन Neuroblast प्रवास की जांच न्यूरोजेनेसिस समझने के लिए न केवल मौलिक लेकिन यह भी संभावित चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए है.
यहाँ, हम vivo में प्रसव के बाद electroporation द्वारा SVZ तंत्रिका progenitors लेबल और समय चूक कताई डिस्क confocal microsco का उपयोग तीव्र मस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों में आरएमएस साथ उनके प्रवास नजर रखने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णनpy. Electroporation व्यापक रूप से भ्रूण से वयस्क चरणों 14-18 को विकास अध्ययन में प्रयोग किया जाता है. यह SVZ तंत्रिका progenitors लक्ष्य और हेरफेर करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है और ट्रांसजेनिक मॉडल 1,15,19,20 के वायरल वैक्टर या पीढ़ी की stereotactic इंजेक्शन के लिए एक सस्ता और काफी तेजी से विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है. यह सर्जरी की जरूरत है और उच्च जीवित रहने की दर है नहीं है एक अपेक्षाकृत सरल प्रक्रिया है. ShRNA या LoxP प्रणाली ब्याज की जीन को लक्षित करने या SVZ progenitors के स्थायी लेबलिंग प्राप्त करने के लिए, इस प्रकार वयस्क neurogenesis पढ़ाई 21,22 के लिए एक उपयोगी उपकरण का प्रतिनिधित्व किया जा सकता है रोजगार माउस आनुवंशिक मॉडल में Cre recombinase व्यक्त plasmids के electroporation.
बरकरार मस्तिष्क में इमेजिंग आरएमएस Neuroblast प्रवास अभी भी कारण वर्तमान तकनीकी सीमाओं को चुनौती दे रहा है. हालांकि, इस प्रक्रिया को एक उपयुक्त syst प्रदान जो तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें के confocal कताई डिस्क समय चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग पर नजर रखी जा सकती हैउन्हें बारीकी से औषधीय हेरफेर 23,24 करने के लिए भी उत्तरदायी में विवो हालत जैसी. समय चूक इमेजिंग के साथ vivo प्रसव के बाद electroporation में युग्मन Neuroblast गतिशीलता को नियंत्रित आणविक तंत्र की समझ की सुविधा और मस्तिष्क की मरम्मत को बढ़ावा देने के लिए उपन्यास दृष्टिकोण के विकास के लिए योगदान देगा.
Protocol
Representative Results
Discussion
आरएमएस साथ तंत्रिका progenitors के कुशल प्रवास कार्यात्मक न्यूरॉन्स 10 में उनके बाद परिपक्वता सुनिश्चित करता है. ओबी की ओर निर्देशित तंत्रिका progenitors की प्रमुख नदियों मानव प्रारंभिक अवस्था में दिखाई दे रहे …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एमएस और YZ KCl और KCL चीन पीएचडी द्वारा समर्थित हैं. एमओ एक जैव प्रौद्योगिकी और जैव विज्ञान अनुसंधान परिषद पीएचडी छात्रवृत्ति के द्वारा वित्त पोषित किया गया. हम electroporation पर मूल्यवान सलाह के लिए Masaru Okabe और जून इची मियाज़ाकी PCX-EGFP प्लाज्मिड के लिए और एलेन Chedotal और एथेना Ypsilanti धन्यवाद.
Materials
| Millicell | Millipore | PICM0RG50 | |
| 35 mm Glass bottom culture dish | MatTek | P35G-0-14-C | |
| Gey's Balanced media | Sigma | G9779-500ML | |
| Glucose, 45% | Sigma | G8769-100ML | |
| HEPES | Sigma | H3375-25G | |
| Pen/Strep | GIBCO | 15140-122 | |
| FCS | GIBCO | 10109-163 | |
| B27 supplement | Invitrogen Life Technologies | 17504044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen Life Technologies | 25030-081 | |
| DMEM (phenol red-free) | GIBCO | 31053-028 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Glass capillaries for injection | Harvard Apparatus | 30-0057 | |
| Aspirator tube | Sigma | A5177 | |
| Sutter P-97 capillary puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Platinum Tweezertrodes 7 mm | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Footswitch Model 1250F | Harvard Apparatus | 45-0211 | |
| Gel for electrodes | Cefar Compex | 6602048 | |
| Isoflurane | Merial | AP/DRUGS/220/96 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Glue | Roti coll | Roti coll 1 | |
| UltraViEW VoX spinning disk system | Perkin Elmer | Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Acquisition, Quantitation, Visualization Modules | |
| Environmental chamber for microscopy | Solent Scientific | Custom-made | |
| Ti-E inverted microscope | Nikon | CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper |
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