مراقبة وقياس حجم فيبرين جل ضغط الخلايا الليفية بوساطة
Summary
واستخدمت تقنيات الفحص المجهري ومعالجة الصور الفاصلة زمنيا لمراقبة وتحليل ضغط هلامي بوساطة الخلايا الليفية وإعادة تنظيم ألياف الفيبرين في مفاعل حيوي خاضع للرقابة البيئية على مدى فترة 48 ساعة.
Abstract
الخلايا المضمنة في الكولاجين والمواد الهلامية الفيبرين نعلق وممارسة قوى الجر على ألياف الجل. ويمكن أن تؤدي هذه القوى إلى إعادة تنظيم وإعادة تنظيم الهيكل المجهري الهلامي على الصعيدين المحلي والعالمي. هذه العملية تسير بطريقة معقدة تعتمد جزئيا على التفاعل بين موقع الخلايا، وهندسة الجل، والقيود الميكانيكية على الجل. لفهم أفضل لكيفية إنتاج هذه المتغيرات لأنماط محاذاة الألياف العالمية، نستخدم المجهر التبايني للتداخل الفاصل الزمني (DIC) إلى جانب مفاعل حيوي يتم التحكم فيه بيئيا لمراقبة عملية الضغط بين النباتات المجهرية المتباعدة هندسيا (مجموعات من الخلايا الليفية). ثم يتم تحليل الصور مع خوارزمية معالجة الصور المخصصة للحصول على خرائط للإجهاد. ويمكن استخدام المعلومات التي تم الحصول عليها من هذه التقنية للتحقيق في علم الأحياء الميكانيكية لمختلف التفاعلات مصفوفة الخلية، والتي لها آثار هامة لفهم العمليات في التئام الجروح، وتطوير الأمراض، وتطبيقات هندسة الأنسجة.
Introduction
أداة هامة لدراسة التفاعلات مصفوفة الخلية هو هلام الكولاجين المأهولة بالخلايا1،2. الجل يوفر بيئة 3D التي هي أقرب إلى الطابع في الجسم الحي من الأنسجة وأكثر ملاءمة لفهم سلوك الخلية مما تقدمه الثقافات التقليدية 2D3. الدراسات المبكرة التي تم توزيعها بشكل متجانس الخلايا الليفية داخل هلام الكولاجين وجدت أن الخلايا توطيد بسرعة ألياف الكولاجين وضغط هلام4,5. الخلايا الليفية انقباش في المواد الهلامية العائمة الحرة ثم الانتقال إلى حالة هادئة بعد فترة وجيزة من هلام وصلت تماما ضغط1,6,7. الخلايا الليفية في المواد الهلامية التي هي مقيدة عند الحدود لا تزال في حالة نشطة، الاصطناعية8 وأنها تولد محاذاة الألياف بطريقة تعتمد على هندسة هلام والقيود الخارجية5،9. الاختلافات في نشاط الخلية ويبدو أن نتيجة للتوتر الداخلي (أو عدمه) التي تتطور كما الخلايا ممارسة قوى الجر عن طريق integrins على ألياف الكولاجين في هلام.
وهناك متغير من هذه التقنية ينطوي على وضع explants الخلايا الليفية(أي كتل من الخلايا) على مسافة بعيدا داخل هلام الكولاجين ومراقبة التفاعلات الخلية مصفوفة والتطور التدريجي للمحاذاة الألياف بين explants (تسمى أحيانا الأشرطة مثل الرباط)10-12. الميزة الأساسية للنظام explant هو أنه يسمح للمرء لترتيب الخلايا في أنماط هندسية بسيطة، مما يجعل من الأسهل تصور والتحقيق في الآليات الكامنة وراء إعادة تنظيم الألياف التي تحركها الخلية. هذه الأنماط المحاذاة — التي تعتمد أساسا على التفاعل بين قوى الجر الخلية, توزيع الخلية المكانية, هندسة هلام, والقيود الميكانيكية على هلام — من المهم أن نفهم لأنها تلعب دورا مركزيا في تنظيم الأنسجة العالمية, وظيفة ميكانيكية, والبيئة الميكانيكية المحلية13.
في مجال هندسة الأنسجة ، تتضمن إحدى استراتيجيات إنتاج الأنسجة الوظيفية ميكانيكيا والمهندسة التحكم في نمط محاذاة الألياف الذي يتطور من ضغط الخلايا بحيث تمتلك الأنسجة المهندسة محاذاة الألياف التي تحاكي محاذاة الأنسجة الأصلية14،15. ويعتقد أن مثل هذا المحاذاة ضروري للأنسجة المهندسة لتكرار السلوك الميكانيكي المعقد للأنسجة الأصلية. تعديل هذه الاستراتيجية هو استبدال هلام الكولاجين مع هلام الفيبرين16. هلام الفيبرين يطور نمط محاذاة مماثل لهلام الكولاجين أثناء الضغط. مع مرور الوقت هو المتدهورة الفيبرين واستبدالها مع ECM توليفها الخلية التي تتبع نمط محاذاة الألياف الفيبرين الأولية. وقد أدى البناء المهندس الناتج إلى تحسين الخصائص الميكانيكية بشكل كبير مقارنة ببنيات هلام الكولاجين المشتقة17.
عملية المحاذاة والأحداث إعادة عرض لاحقة في المواد الهلامية الفيبرين المضي قدما بطريقة معقدة وغير مفهومة بشكل جيد. لتوصيف هذه التفاعلات بشكل أفضل وتأثيرها على سلوك الخلية وإعادة عرض ECM ، قمنا بتطوير إجراء يستند إلى طريقة الزرع. في هذه الطريقة، يتم وضع explants الخلايا الليفية على هلام الفيبرين في أنماط هندسية مختلفة. يتم الحفاظ على المواد الهلامية في مفاعل حيوي18يتم التحكم فيه بيئيا ، ويتم مراقبة عملية الضغط وإعادة تنظيم الألياف باستخدام المجهر التفاضلي للتداخل الفاصل الزمني (DIC). يتم قياس حقول الإزاحة كميا باستخدام خوارزميات مخصصة. البيانات التي تم الحصول عليها من هذه التجارب لها آثار واسعة النطاق على عدد من العمليات، بما في ذلك تحسين استراتيجيات هندسة الأنسجة، وتحسين التئام الجروح، وعلاج إعادة عرض الأنسجة المرضية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد وضع هذا البروتوكول لغرض مراقبة وقياس الميكانيكا التي تنطوي عليها عملية إعادة تشكيل نظام الرصد الأوروبي بوساطة الخلية. هذه العمليات تكمن وراء عدد من الظواهر البيولوجية ولها آثار هامة على الأنسجة الهندسية2,22, الحد منندبة 1,23, وفهم إعادة عرض الأنسجة المرضية12,24. استخدام ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر جورج جوديس وستيفن إلياسون على التبرع بالخلايا الليفية الجلدية البشرية وراميش راغوباثي للمساعدة في خوارزمية تتبع الإجهاد. تم تقديم الدعم لهذا العمل من قبل وزارة التعليم الأميركية مساعدة الدراسات العليا في مجالات الحاجة الوطنية زمالة (GAANN P200A120071).
Materials
| Sigma-Aldrich | F8630 | |
| Sigma-Aldrich | T4648 | |
| Gibco | 11965-092 | |
| Gibco | 15140-122 | |
| Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Gibco | 25200-056 | |
| Invitrogen | 3000 | |
| Lonza | DE14-701F | |
| Molecular Probes | F8858 | |
| GIBCO | A10483-01 | |
| GIBCO | 11430-030 | |
| Fisher-Scientific | SS264-1 | |
| Sigma-Aldrich | A3428-25MG | |
| Biotense Bioreactor | ADMET | |
| Ti-Eclipe Microscope | Nikon | |
| # 0 35 mm Glass Bottom Petri Dish | MatTek | P35G-0-20-C |
| # 0 35 mm Glass Top Petri Dish | MatTek | P35GTOP-0-20-C |
| Plastic Luer fittings, PVC tubing with Luer ends | Cole-Parmer | 30600-65 |
References
- Grinnell, F., Petroll WM, . Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2001).
- Sander, E. A., Barocas, V. H. . Biomimetic collagen tissues: collagenous tissue engineering and other applications. In: Collagen: Structure and Mechanics. , (2008).
- Pedersen JA, ., Swartz MA, . Mechanobiology in the third dimension. Ann. Biomed. Eng. 33 (11), 1469-1490 (2005).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (3), 1274 (1979).
- Guidry, C., Grinnell, F. Studies on the mechanism of hydrated collagen gel reorganization by human skin fibroblasts. J. Cell. Sci. 79 (1), 67-81 (1985).
- Fluck, J., Querfeld, C., Cremer, A., Niland, S., Krieg, T., Sollberg, S. Normal human primary fibroblasts undergo apoptosis in three-dimensional contractile collagen gels. J. Invest. Dermatol. 110 (2), 153-157 (1998).
- Rosenfeldt, H., Grinnell, F. Fibroblast quiescence and the disruption of ERK signaling in mechanically unloaded collagen matrices. J. Biol. Chem. 275 (5), 3088-3092 (2000).
- Nakagawa, S., Pawelek, P., Grinnell, F. Long-term culture of fibroblasts in contracted collagen gels: Effects on cell growth and biosynthetic activity. J. Invest. Dermatol. 93 (6), 792-798 (1989).
- Harris, A. K., Stopak, D., Wild, P. Fibroblast traction as a mechanism for collagen morphogenesis. Nature. 290, 249-251 (1981).
- Stopak, D., Harris AK, . Connective tissue morphogenesis by fibroblast traction: I. tissue culture observations. Dev. Biol. 90 (2), 383-398 (1982).
- Sawhney, R. K., Howard, J. Slow local movements of collagen fibers by fibroblasts drive the rapid global self-organization of collagen gels. J. Cell. Biol. 157 (6), 1083-1092 (2002).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by rho/ROCK-dependent matrix reorganization. Biophys. J. 95 (11), 5374 (2008).
- Sander, E., Barocas, V., Tranquillo, R. Initial fiber alignment pattern alters extracellular matrix synthesis in fibroblast-populated fibrin gel cruciforms and correlates with predicted tension. Ann. Biomed. Eng. 39 (2), 714-729 (2011).
- Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. An anisotropic biphasic theory of tissue-equivalent mechanics: the interplay among cell traction, fibrillar network deformation, fibril alignment, and cell contact guidance. J. Biomech. Eng. 119, 137-146 (1997).
- Neidert, M. R., Tranquillo, R. T. Tissue-engineered valves with commissural alignment. Tissue Eng. 12 (4), 891-903 (2006).
- Robinson PS, ., Robinson PS, . Planar biaxial behavior of fibrin-based tissue-engineered heart valve leaflets. Tissue Eng. Part A. 15 (10), 2763-2772 (2009).
- Grassl, E., Oegema, T., Tranquillo, R. Fibrin as an alternative biopolymer to type I collagen for the fabrication of a media equivalent. J. Biomed. Mater. Res. 60 (4), 607-612 (2002).
- Paten, J. A., Zareian, R., Saeidi, N., Melotti, S. A., Ruberti, J. W. Design and performance of an optically accessible, low-volume, mechanobioreactor for long-term study of living constructs. Tissue Eng. Part C Methods. 17 (7), 775-788 (2001).
- Ye KY, ., Sulli van KE, ., Black LD, . Encapsulation of cardiomyocytes in a fibrin hydrogel for cardiac tissue engineering. J. Vis. Exp. (55), (2011).
- Ahmann, K. A., Weinbaum, J. S., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Fibrin degradation enhances vascular smooth muscle cell proliferation and matrix deposition in fibrin-based tissue constructs fabricated in vitro. Tissue Eng. Part A. 16 (10), 3261-3270 (2010).
- Raghupathy, R., Witzenburg, C., Lake, S. P., Sander, E. A., Barocas, V. H. Identification of regional mechanical anisotropy in soft tissue analogs. J. Biomech. Eng. 133, (2011).
- Robinson, P. S., Johnson, S. L., Evans, M. C., Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. Functional tissue-engineered valves from cell-remodeled fibrin with commissural alignment of cell-produced collagen. Tissue Eng. Part A. 14 (1), 83-95 (2008).
- Gabbiani, G. The myofibroblast in wound healing and fibrocontractive diseases. J. Pathol. 200 (4), 500-503 (2003).
- PaszeK, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Grinnell, F., Rocha L, B., Iucu, C., Rhee, S., Jiang, H. Nested collagen matrices: A new model to study migration of human fibroblast populations in three dimensions. Exp. Cell. Res. 312 (1), 86-94 (2006).
- Miron-Mendoza, M., Seemann, J., Grinnell, F. The differential regulation of cell motile activity through matrix stiffness and porosity in three dimensional collagen matrices. Biomaterials. 31 (25), 6425-6435 (2010).
- Wakatsuki, T., Kolodney MS, ., Zahalak GI, ., Elson EL, . Cell mechanics studied by a reconstituted model tissue. Biophys. J. 79 (5), 2353-2368 (2000).
- De Jesus, A., Aghvami, M., Sander, E. Fibroblast-mediated fiber realignment in fibrin gels. , (2013).
- Aghvami, M., Barocas, V. H., Sander, E. A. Multiscale mechanical simulations of cell compacted collagen gels. J. Biomech. Eng. 135, (2013).
