Наблюдение и количественная оценка Фибробластовой Фибрин Гель Компактион

Summary

Для наблюдения и анализа фибробластного уплотнения геля и перестройки фибринового волокна в экологически контролируемом биореакторе в течение 48 часов использовались методы обработки во времени и обработки изображений.

Abstract

Клетки, встроенные в коллагеновые и фибринные гели, прикрепляют и оказывают тяговые силы на волокна геля. Эти силы могут привести к локальной и глобальной реорганизации и перестройке микроструктуры геля. Этот процесс проходит сложным образом, что частично зависит от взаимодействия между расположением клеток, геометрией геля и механическими ограничениями на гель. Чтобы лучше понять, как эти переменные производят глобальные модели выравнивания волокон, мы используем микроскопию дифференциального интерференции (DIC) замедленного действия (DIC) в сочетании с экологически контролируемым биореактором для наблюдения за процессом уплотнения между геометрически распропоискными эксплантами (кластерами фибробластов). Изображения затем анализируются с помощью пользовательского алгоритма обработки изображений для получения карт штамма. Информация, полученная из этого метода может быть использована для зондирования механобиологии различных клеточно-матричных взаимодействий, которая имеет важные последствия для понимания процессов в заживлении ран, развитии болезней и тканевой инженерии приложений.

Introduction

Важным инструментом для изучения клеточно-матричных взаимодействий является клеток, населенных коллагеновым^{гелем 1,2.} Гель обеспечивает 3D среду, которая ближе к in vivo характер ткани и лучше подходит для понимания поведения клеток, чем предлагается традиционными 2D культур³. Ранние исследования, в которых фибробласты были однородно распределены в коллагеновый гель обнаружили, что клетки быстро консолидировать коллагеновые волокна и компактный^{гель 4,5}. Контрактные фибробласты в свободных плавающих гелях затем переходят в состояние добела вскоре после того, как гель полностью достиг^{уплотнения 1,6,7}. Фибробласты в гелях, которые ограничены на границах, остаются в активном,^{синтетическом состоянии 8} и генерируют выравнивание волокон таким образом, в зависимости от геометрии^{геля и внешних ограничений 5,9}. Различия в активности клеток, как представляется, в результате внутреннего напряжения (или его отсутствие), которое развивается, как клетки оказывают силы тяги через интегрны на коллагеновых волокон в гель.

Вариант этого метода включает в себя размещение фибробластов explants(т.е. скопления клеток) на расстоянии друг от друга в коллагеновом геле и наблюдения клеточной матрицы взаимодействия и постепенное развитие волокна выравнивание между explants (иногда называемые связки, как ремни)^10-12. Основным преимуществом системы эксплантов является то, что она позволяет упорядочить клетки в простые геометрические узоры, что облегчает визуализацию и зондирование механизмов, лежащих в основе перестройки волокон, управляемых клетками. Эти модели выравнивания – которые зависят главным образом от взаимодействия между силами тяги клетки, spatial распределением клетки, геометрией геля, и механически ограничениями на геле – важны для того чтобы понять потому что они играют центральную роль в глобальной организации ткани, механически функции, и местной^{механической окружающей среде 13.}

В области тканевой инженерии, одна стратегия для производства механически функциональных, инженерии тканей включает в себя контроль волокна выравнивание шаблон, который развивается из уплотнения клеток, так что инженерии ткани обладает волокна выравнивание, которое имитирует, что из^{родной ткани 14,15}. Такое выравнивание считается необходимым для инженерных тканей, чтобы повторить сложное механическое поведение местных тканей. Модификация этой стратегии заключается в замене коллагенового геля фибрином гель¹⁶. Фибрин гель развивается аналогичная модель выравнивания, как коллагеновый гель во время уплотнения. Со временем фибрин деградирует и заменяется синтезированными клетками ECM, что следует первоначальному шаблону выравнивания фибринового волокна. Полученная конструкция значительно улучшила механические свойства по сравнению с коллагеновым гелем, полученным конструкцией^17.

Процесс выравнивания и последующей реконструкции событий в фибриновых гелях проходить в сложной и плохо понятой манере. Чтобы лучше охарактеризовать эти взаимодействия и их влияние на поведение клеток и ЭКМ ремоделирование, мы разработали процедуру, которая основана на методе экспланта. В этом методе фибробласты explants расположены на фибриновом геле в различных геометрических узоров. Гели поддерживаются в экологически контролируемом, микроскоп-установлен^{биореакторе 18}, и процесс уплотнения и перестройки волокна контролируется с помощью контрастной по времени дифференциальной интерференционной микроскопии (DIC). Поля перемещения количественно определены с помощью пользовательских алгоритмов. Данные, полученные в ходе этих экспериментов, имеют широкий спектр последствий для ряда процессов, включая оптимизацию стратегий проектирования тканей, улучшение заживления ран и лечение ремоделирования патологических тканей.

Protocol

1. Подготовка к трафарету Подготовь трафарет на Парафильме, чтобы сабографить расположение каждого экспланта, следуя желаемойгеометрии (рисунки 1A и 1B). Пространство каждого explant примерно 1-2 мм друг от друга. Это расстояние соответствует идеально…

Representative Results

Ткань ремоделирования является сложным процессом, который обусловлен частично взаимных физических взаимодействий между клетками и окружающей матрицы. Клетки реорганизуют окружающие волокна и создают напряжение в волоконной сети. Выравнивание волокон и механической среды, в свою оч?…

Discussion

Этот протокол был разработан с целью наблюдения и количественной оценки механики, участвуют в клеточной ремоделирования ECM. Такие процессы лежат в основе ряда биологических явлений и имеют важные^{последствия для инженерных тканей 2,22,уменьшая шрам 1,23}, и понимание патологиче…

Materials

Sigma-Aldrich	F8630
Sigma-Aldrich	T4648
Gibco	11965-092
Gibco	15140-122
Sigma-Aldrich	A2942
Sigma-Aldrich	H0887
Sigma-Aldrich	223506
Gibco	25200-056
Invitrogen	3000
Lonza	DE14-701F
Molecular Probes	F8858
GIBCO	A10483-01
GIBCO	11430-030
Fisher-Scientific	SS264-1
Sigma-Aldrich	A3428-25MG
Biotense Bioreactor	ADMET
Ti-Eclipe Microscope	Nikon
# 0 35 mm Glass Bottom Petri Dish	MatTek	P35G-0-20-C
# 0 35 mm Glass Top Petri Dish	MatTek	P35GTOP-0-20-C
Plastic Luer fittings, PVC tubing with Luer ends	Cole-Parmer	30600-65