Observando e quantificando compactação de gel de fibrina mediada por fibroblasto
Summary
Foram utilizadas técnicas de microscopia e processamento de imagem com lapso de tempo para observar e analisar a compactação de gel mediada por fibroblasto e o realinhamento da fibra fibrina em um bioreator ambientalmente controlado durante um período de 48 horas.
Abstract
Células embutidas em géis de colágeno e fibrina ligam e exercem forças de tração sobre as fibras do gel. Essas forças podem levar à reorganização local e global e ao realinhamento da microestrutura de gel. Esse processo prossegue de forma complexa e dependente, em parte, da interação entre a localização das células, a geometria do gel e as restrições mecânicas do gel. Para entender melhor como essas variáveis produzem padrões globais de alinhamento de fibras, usamos microscopia de contraste diferencial de impacto de lapso de tempo (DIC) juntamente com um bioreator ambientalmente controlado para observar o processo de compactação entre explantas geométricas espaçadas (clusters de fibroblastos). As imagens são então analisadas com um algoritmo de processamento de imagem personalizado para obter mapas da cepa. As informações obtidas a partir desta técnica podem ser usadas para sondar a mecanobiologia de várias interações de matriz celular, o que tem implicações importantes para a compreensão de processos em aplicações de cicatrização de feridas, desenvolvimento de doenças e engenharia de tecidos.
Introduction
Uma ferramenta importante para estudar as interações entre células e matrizes é o gel de colágeno povoadocelular 1,2. O gel fornece um ambiente 3D mais próximo do caráter in vivo do tecido e mais adequado para entender o comportamento celular do que é oferecido pelas culturas 2D tradicionais3. Estudos iniciais nos quais os fibroblastos foram distribuídos de forma homogênea dentro de um gel de colágeno descobriram que as células consolidam rapidamente as fibras de colágeno e compactam o gel4,5. Os fibroblastos contratuais em géis flutuantes livres então transitam para um estado quiescente logo após o gel ter atingido totalmente a compactação1,6,7. Os fibroblastos em géis que são limitados nos limites permanecem em estado ativo e sintético8 e geram alinhamento de fibras de forma dependente da geometria do gel e restrições externas5,9. As diferenças na atividade celular parecem ser resultado da tensão interna (ou falta dela) que se desenvolve à medida que as células exercem forças de tração através de integrins nas fibras de colágeno no gel.
Uma variante dessa técnica envolve colocar explantas de fibroblastos (ou seja, aglomerados de células) a uma distância entre um gel de colágeno e observar interações de matriz celular e o desenvolvimento gradual do alinhamento de fibras entre as explantas (às vezes chamadas de correias ligamentares)10-12. A principal vantagem do sistema de explant é que ele permite que se organize as células em padrões geométricos simples, o que torna mais fácil visualizar e sondar os mecanismos subjacentes ao realinhamento de fibras orientados por células. Esses padrões de alinhamento — que dependem principalmente da interação entre as forças de tração celular, distribuição espacial celular, geometria do gel e as restrições mecânicas do gel — são importantes de entender porque desempenham um papel central na organização global de tecidos, função mecânica e ambiente mecânico local13.
No campo da engenharia de tecidos, uma estratégia para a produção de tecidos mecanicamente funcionais e projetados envolve o controle do padrão de alinhamento de fibras que se desenvolve a partir da compactação celular para que o tecido projetado possua alinhamento de fibras que imita o do tecido nativo14,15. Acredita-se que tal alinhamento seja necessário para que os tecidos projetados repliquem o complexo comportamento mecânico dos tecidos nativos. Uma modificação dessa estratégia é substituir o gel de colágeno por um gel de fibrina16. O gel de fibrina desenvolve um padrão de alinhamento semelhante ao de um gel de colágeno durante a compactação. Com o tempo, a fibrina é degradada e substituída por ECM sintetizado por células que segue o padrão inicial de alinhamento da fibra fibrina. A construção projetada resultante melhorou significativamente as propriedades mecânicas em comparação com as construções derivadas de gel de colágeno17.
O processo de alinhamento e os eventos subsequentes de remodelação em géis de fibrina prosseguem de forma complicada e mal compreendida. Para caracterizar melhor essas interações e seu efeito sobre o comportamento celular e a remodelação do ECM, desenvolvemos um procedimento baseado no método de explant. Neste método, explantas de fibroblasto são posicionadas em um gel de fibrina em diferentes padrões geométricos. Os géis são mantidos em um bioreator18controlado pelo microscópio, controlado pelo microscópio, e o processo de compactação e realinhamento de fibras é monitorado com microscopia de contraste diferencial de interferência de lapso de tempo (DIC). Os campos de deslocamento são quantificados com algoritmos personalizados. Os dados obtidos a partir desses experimentos têm amplas implicações para uma série de processos, incluindo a otimização de estratégias de engenharia tecidual, a melhoria da cicatrização de feridas e o tratamento da remodelação patológica do tecido.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo foi desenvolvido com o objetivo de observar e quantificar a mecânica envolvida na remodelação do ECM mediado por células. Tais processos estão por trás de uma série de fenômenos biológicos e têm implicações importantes para os tecidos de engenharia2,22, reduzindo a cicatriz1,23, e entendendo a remodelação do tecido patológico12,24. O uso de microscopia DIC de lapso de tempo permite resolver e quantificar o deslocamento e o alinhamento das fibras fibrinas que …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a George Giudice e Steven Eliason por doarem fibroblastos dérmicos humanos e Ramesh Raghupathy por ajuda com o algoritmo de rastreamento de cepas. O apoio a este trabalho foi fornecido por um Departamento de Educação do Departamento de Educação dos EUA em Áreas de Bolsa de Necessidade Nacional (GAANN P200A120071).
Materials
| Sigma-Aldrich | F8630 | |
| Sigma-Aldrich | T4648 | |
| Gibco | 11965-092 | |
| Gibco | 15140-122 | |
| Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Gibco | 25200-056 | |
| Invitrogen | 3000 | |
| Lonza | DE14-701F | |
| Molecular Probes | F8858 | |
| GIBCO | A10483-01 | |
| GIBCO | 11430-030 | |
| Fisher-Scientific | SS264-1 | |
| Sigma-Aldrich | A3428-25MG | |
| Biotense Bioreactor | ADMET | |
| Ti-Eclipe Microscope | Nikon | |
| # 0 35 mm Glass Bottom Petri Dish | MatTek | P35G-0-20-C |
| # 0 35 mm Glass Top Petri Dish | MatTek | P35GTOP-0-20-C |
| Plastic Luer fittings, PVC tubing with Luer ends | Cole-Parmer | 30600-65 |
References
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