Observera och kvantifiera Fibroblastmedierad Fibrin Gel Compaction

Summary

Time-lapse mikroskopi och bild bearbetning tekniker användes för att observera och analysera fibroblast-medierad gel komprimering och fibrin fiberjustering i en miljökontrollerad bioreaktor under en 48 timmar period.

Abstract

Celler inbäddade i kollagen och fibringeler fäster och utövar dragkrafter på gelens fibrer. Dessa krafter kan leda till lokal och global omorganisation och omjustering av gelmikrostrukturen. Denna process fortsätter på ett komplext sätt som delvis är beroende av samspelet mellan cellernas placering, gelens geometri och de mekaniska begränsningarna på gelén. För att bättre förstå hur dessa variabler producerar globala fiberjusteringsmönster använder vi DIC-mikroskopi (Time-Lapse Differential Interference Contrast) i kombination med en miljökontrollerad bioreaktor för att observera komprimeringsprocessen mellan geometriskt fördelade explanter (kluster av fibroblaster). Bilderna analyseras sedan med en anpassad bildbehandlingsalgoritm för att få kartor över stammen. Informationen som erhålls från denna teknik kan användas för att undersöka mekanobiologin hos olika cellmatrisinteraktioner, vilket har viktiga konsekvenser för att förstå processer i sårläkning, sjukdomsutveckling och vävnadstekniska applikationer.

Introduction

Ett viktigt verktyg för att studera cellmatrisinteraktioner är cellbefolkad kollagengel^1,2. Gelén ger en 3D-miljö som ligger närmare vävnadens in vivo-karaktär och bättre lämpad för att förstå cellbeteende än vad som erbjuds av traditionella 2D-kulturer³. Tidiga studier där fibroblaster var homogent fördelade inom en kollagengel fann att cellerna snabbt konsoliderar kollagenfibrerna och komprimerar gelén^4,5. De kontraktila fibroblasterna i fria flytande geler övergår sedan till ett quiescent tillstånd strax efter att gelén helt har nått^{komprimering 1,6,7}. Fibroblasterna i geler som är begränsade vid gränserna förblir i ett aktivt, syntetiskt tillstånd^{8 och} de genererar fiberjustering på ett sätt som är beroende av gelgeometri och yttre^{begränsningar 5,9}. Skillnader i cellaktivitet verkar vara ett resultat av den inre spänningen (eller bristen på sådan) som utvecklas när cellerna utövar dragkrafter via integrins på kollagenfibrerna i gelén.

En variant av denna teknik innebär att placera fibroblastexplanter(dvs. klumpar av celler) ett avstånd från varandra i en kollagengel och observera cellmatrisinteraktioner och den gradvisa utvecklingen av fiberjustering mellan explanterna (ibland kallade ligamentliknande remmar)^10-12. Den främsta fördelen med explantsystemet är att det gör det möjligt att ordna cellerna till enkla geometriska mönster, vilket gör det lättare att visualisera och undersöka mekanismerna bakom celldriven fiberjustering. Dessa justeringsmönster – som främst är beroende av samspelet mellan celldragkrafter, cell rumslig fördelning, gelgeometri och de mekaniska begränsningarna på gelén – är viktiga att förstå eftersom de spelar en central roll i global vävnadsorganisation, mekanisk funktion och lokal mekanisk miljö¹³.

Inom vävnadsteknik innebär en strategi för att producera mekaniskt funktionella, konstruerade vävnader att kontrollera fiberjusteringsmönstret som utvecklas från cellkomprimering så att den konstruerade vävnaden har fiberjustering som efterliknar den inhemska^{vävnaden 14,15}. Sådan inriktning tros nödvändig för konstruerade vävnader för att replikera det komplexa mekaniska beteendet hos inhemska vävnader. En modifiering av denna strategi är att ersätta kollagengelen med en fibringel¹⁶. Fibringelen utvecklar ett liknande inriktningsmönster som kollagengel under komprimering. Med tiden bryts fibrinen ned och ersätts med cellsyntiserad ECM som följer det ursprungliga fibrinfiberjusteringsmönstret. Den resulterande konstruerade konstruktionen har avsevärt förbättrat mekaniska egenskaper jämfört med kollagengel härledda konstruktioner¹⁷.

Justeringsprocessen och efterföljande ombyggnadshändelser i fibrin geler fortsätter på ett komplicerat och dåligt förstått sätt. För att bättre karakterisera dessa interaktioner och deras effekt på cellbeteende och ECM-ombyggnad har vi utvecklat ett förfarande som bygger på explantmetoden. I denna metod placeras fibroblastexplanter på en fibringel i olika geometriska mönster. Gelerna hålls i en miljöstyrd, mikroskopmonterad bioreaktor¹⁸, och processen med komprimering och fiberjustering övervakas med DIC-mikroskopi (time-lapse differential interference contrast). Förskjutningsfält kvantifieras med anpassade algoritmer. De data som erhålls från dessa experiment har omfattande konsekvenser för ett antal processer, inklusive optimering av vävnadstekniska strategier, förbättring av sårläkning och behandling av patologisk vävnadsrenovering.

Protocol

1. Stencil förberedelse Förbered en stencil på Parafilm för att utforma platsen för varje explant, enligt önskad geometri (figurerna 1A och 1B). Utrymme varje explant ca 1-2 mm från varandra. Detta avstånd motsvarar ett idealiskt avstånd för att generera fiberjustering mellan explanter. Fäst stencilen under täckglasområdet där provet ska beredas med tejp. 2. Sterilisering Rengö…

Representative Results

Ombyggnad av vävnad är en komplex process som delvis drivs av ömsesidiga fysiska interaktioner mellan celler och den omgivande matrisen. Cellerna omorganiserar de omgivande fibrerna och genererar spänningar i fibernätet. Justeringen av fibrer och mekanisk miljö styr i sin tur cellbeteendet, så att både celler och matris globalt omorganiseras för att producera ombyggd vävnad. I detta experiment började explanternas celler, ursprungligen runda i morfologi, sträcka sig in i gelén och hålla fast vid fibrinfibre…

Discussion

Detta protokoll utvecklades i syfte att observera och kvantifiera mekaniken som är involverad i cellmedierad ECM-ombyggnad. Sådana processer ligger till grund för ett antal biologiska fenomen och har viktiga konsekvenser för tekniska^{vävnader 2,22}, minskar^{ärr 1,23}, och förstår patologisk vävnad ombyggnad^12,24. Användningen av tidsfördröjning DIC-mikroskopi gör det möjligt att lösa och kvantifiera förskjutningen och justeringen av fibrinfibrer som uppstår som ett resultat a…

Materials

Sigma-Aldrich	F8630
Sigma-Aldrich	T4648
Gibco	11965-092
Gibco	15140-122
Sigma-Aldrich	A2942
Sigma-Aldrich	H0887
Sigma-Aldrich	223506
Gibco	25200-056
Invitrogen	3000
Lonza	DE14-701F
Molecular Probes	F8858
GIBCO	A10483-01
GIBCO	11430-030
Fisher-Scientific	SS264-1
Sigma-Aldrich	A3428-25MG
Biotense Bioreactor	ADMET
Ti-Eclipe Microscope	Nikon
# 0 35 mm Glass Bottom Petri Dish	MatTek	P35G-0-20-C
# 0 35 mm Glass Top Petri Dish	MatTek	P35GTOP-0-20-C
Plastic Luer fittings, PVC tubing with Luer ends	Cole-Parmer	30600-65