Цельноклеточная MALDI-TOF масс-спектрометрии является точным и быстрым методом для анализа различных режимах активации макрофагов

Краткое содержание

Этот протокол описывает использование полноклеточной масс-спектрометрии MALDI-TOF на эукариотических клетках. Здесь мы проиллюстрируем точность этого метода, проанализировав множественные состояния активации макрофагов в ответ на их микроокружение.

Аннотация

MALDI-TOF - это широко используемый метод масс-спектрометрии в химии и биохимии. Он также применяется в медицине для идентификации молекул и биомаркеров. В последнее время он используется в микробиологии для рутинной идентификации бактерий, выращенных из клинических образцов, без этапов подготовки или фракционирования. Мы и другие успешно применили этот метод масс-спектрометрии MALDI-TOF для полноклеточных клеток к эукариотическим клеткам. В настоящее время она применяется в различных областях: от идентификации типа клеток до контроля качества клеточных культур и диагностических приложений. В этой статье мы описываем его использование для изучения различных поляризационных фенотипов макрофагов в ответ на цитокины или бактерии, убитые теплом. Это позволило идентифицировать макрофагально-специфичные отпечатки пальцев, которые являются репрезентативными для разнообразия протеомных реакций макрофагов. Данное приложение иллюстрирует точность и простоту метода. Описанный нами протокол может быть полезен для изучения иммунного ответа хозяина при патологических состояниях или может быть расширен для более широкого диагностического применения.

Введение

Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) - это популярный метод масс-спектрометрии для изучения биологических образцов. Использование лазерного луча и поглощающей энергию матрицы позволяет осуществить процесс мягкой ионизации: испарение и генезис крупных, в основном однозарядных биомолекул. Этот процесс называется десорбцией/ионизацией, оправдывая аббревиатуру MALDI. Затем эти ионы ускоряются под действием напряжения и поступают в анализатор TOF, который позволяет разделять эти ионы и количественно определять их соответствующие массы¹.

MALDI-TOF MS широко используется в биологии,....

Протокол

В настоящем протоколе метод MALDI-TOF для цельных клеток используется для получения масс-спектра, рассматриваемого как отпечаток пальца образца. Биоинформатический анализ позволил сравнить и классифицировать эти отпечатки пальцев. В этом протоколе было три основные части:

1. Подготовка биологических образцов: контрольные макрофаги и макрофаги стимулируются различными агонистами.
2. Анализ каждого типа образца с техническими репликациями с помощью цельноклеточного MALDI-TOF MS.
3. Биоинформатический анализ исходных данных.

Готовьте стерильные растворы для выделения и культивирования клеток. Готовьте и храните ....

Результаты

Целью настоящего протокола является демонстрация точности метода MALDI-TOF MS целых клеток для оценки реакции макрофагов на их микроокружение.

Рисунок 1 описывает подготовку стимулированных макрофагов из образцов крови. Рисунок 2 представляет анализ моноцитов и MDM с помощью проточной цитометрии. Обратите внимание, что моноциты экспрессировали CD14, но не CD68 (Рисунок 1A). Напротив, MDM экспрессировали CD68, но не CD14 (Рисунок 1B

Обсуждение

Этот протокол описывает применение MALDI-TOF-MS на эукариотических цельных клетках. Здесь мы проиллюстрируем точность метода, проанализировав множественные состояния активации макрофагов в ответ на их микроокружение.

Успех протокола зависит от нескольких критически важных шагов. Во-первых, любой раствор загрязнителя может изменить спектры. Например, важно промывать клетки в PBS для удаления питательных сред и сывороточных белков перед осаждением на мишень. Концентрация клеток 1 x 10^{5 клет.......}