Verbeterde werkwijze voor de bereiding van een Human-Cell gebaseerde, Contact Model van de bloed-hersenbarrière

Summary

Oprichting van menselijke modellen van de bloed-hersenbarrière (BBB) ​​kan profiteren onderzoek naar hersenen voorwaarden in verband met BBB mislukking. We beschrijven hier een verbeterde techniek voor de bereiding van een contact BBB model dat coculturing menselijke astrocyten en brein endotheelcellen maakt aan de tegenovergestelde zijden van een poreus membraan.

Abstract

De bloed-hersenbarrière (BBB) ​​bestaat uit ondoordringbare maar aanpasbare hersenen haarvaten die streng te controleren, de hersenen milieu. Niet de BBB is geïmpliceerd in de etiologie van vele hersenen pathologieën, noopt tot de ontwikkeling van humane in vitro modellen BBB helpt bij klinisch relevante onderzoek. Onder de talrijke BBB modellen dusver beschreven, een statische (zonder stroom), contact BBB model, waarbij astrocyten en de hersenen endotheelcellen (BEC) worden gekweekt samen aan weerszijden van een poreus membraan, ontwikkeld tot een vereenvoudigde, doch authentieke systeem het simuleren BBB met high throughput screening capaciteit. Toch is de generatie van dergelijk model geeft weinig technische uitdagingen. Hier beschrijven we een protocol voor de bereiding van een contact menselijk BBB model gebruik te maken van een nieuwe combinatie van primaire menselijke Becs en onsterfelijke, menselijke astrocyten. Concreet, we detail een innovatieve methode voor cel-zaaien op omgekeerde inserts evenals specificeren insertiet kleurtechnieken en illustreren hoe we ons model voor BBB-gerelateerd onderzoek.

Introduction

De BBB is een gespecialiseerde interface tussen de perifere bloedsomloop en het centrale zenuwstelsel, cruciaal verantwoordelijk voor het onderhoud van hersenen hemostase. Het bestaat uit verschillende hersenen microvasculaire endotheelcellen (BEC) die functioneel worden beïnvloed door enkele cellulaire en acellulaire componenten (hieronder) om een ​​strakke en dynamische gateway in de hersenen vormen. Onder fysiologische omstandigheden de BBB beperkt de doorgang van bloedcellen, plasma componenten en schadelijke stoffen, alle potentieel neurotoxische, in de hersenen. Tegelijkertijd heeft de BBB wisselt selectief sleutel ionen en voedingsstoffen (glucose en aminozuren) en metabolische afvalproducten tussen de hersenen en de circulatie naar de hersenen milieu ^1,2 nauwkeurig te behouden. De laatste jaren is het steeds duidelijk dat de mislukking van BBB voorkomt in een verscheidenheid van chronische hersen aandoeningen zoals neurodegeneratieve en inflammatoire ziekten (Alzheimer en multiple sclerose, respectievelijk) ^3, en bij acute aandoeningen zoals ischemische beroerte ^4.

De unieke eigenschappen BBB hersenen endotheelcellen (BEC) worden grotendeels veroorzaakt door de omgeving cerebrale ^5, en met name door astrocyten ^6,7. Er is een groeiend besef dat andere celtypen, zoals pericyten ^8, neuronen en microglia ^1,3, en de basale membraan ^9, ondersteunt BEC en samen een functionele eenheid zogenaamde "neurovasculaire eenheid" (NVU) die tegelijkertijd koppels neuronale metabole eisen aan hen leveren, haarvaten ^10.

De betrokkenheid van de BBB in pathologische situaties ten grondslag talrijke pogingen om de ontwikkeling van in vitro BBB-modellen ten behoeve van BBB-gerelateerd onderzoek ^11,12. Deze modellen doel zo dicht mogelijk na te bootsen in vivo BBB kenmerken volgens het beginsel NVU. In vitro </em> BBB-modellen over het algemeen rekenen op een monolaag van-tight-junction vormen Becs (vooral van runderen ^13, menselijk ^{14, 15} rat, muis ^16, en varkens ^17,18 afkomst), gekweekt op een poreus membraan alsmede ondersteunend astrocyten (uitgebreid beoordeeld door Deli et al.. 2005 ^11).

Astrocyten kunnen worden gekweekt in contactloze omstandigheden op de bodem van een weefselkweek goed gescheiden van BEC (gekweekt op het bovenoppervlak van het membraan) van het kweekmedium Nog communiceren met BEC via oplosbare factoren ^16. In meer geavanceerde modellen die beter te lijken de anatomische structuur van de BBB in vivo worden astrocyten in contact gehouden omstandigheden gekweekt en direct aan de andere zijde van het membraan dicht bij BEC ^13,15,17 (figuur 1). Deze configuratie maakt het mogelijk fysiek contact tussen Becs en astrocyten, opgericht als astrocyten projecthun processen door het poreuze membraan. Belangrijk, voor een echt contact te komen de poriën dient ≥ 1 urn in diameter, omdat astrocytaire end-voeten niet kan passeren kleinere poriën (dwz 0,4 micrometer) ^14,15. Met name worden contact BBB systemen aangetoond in sommige studies superieur aan hun contactloze tegenhangers over hun trans endotheliale elektrische weerstand (TEER) en endotheliale permeabiliteit van verschillende tracers ^13,17,18 te zijn. Een extra dimensie van doorstroming werd onlangs toegevoegd in een aantal in vitro BBB modellen afschuifkrachten toepassing op het endotheel nauwere simulatie van de hersenen vasculatuur ^12,19.

Een technische hindernis te overwinnen bij het genereren van een contact BBB model is het zaaien van astrocyten tegen de zwaartekracht op het abluminale oppervlak van het poreuze membraan. Eerdere protocollen ^13,20, waar astrocyten eenvoudigweg werden gezaaid in een druppel media bovenop een inomgezet insert, alleen toegestaan ​​korte zaaien tijden (dwz 10 min ¹³ of 2 uur ^20), die werden gevonden in onze handen onvoldoende voor een goede hechting van cellen te zijn. Uitgaande van deze eerste methode, een langer astrocyten bevestiging vereist constante monitoring van de inserts door frequent openen van de incubator (waardoor schommelingen in temperatuur, pH en vocht) en is ook gevoelig voor ongelijkmatige zaaien van cellen door lekkage van media door de poriën, met name indien poriën groter dan 1 micrometer in dienst zijn.

We beschrijven hier een algemeen protocol voor de bereiding van een contact BBB-model. Onze werkwijze omvat een alternatieve werkwijze voor cel-enten op omgekeerde inserts, welke de bovenvermelde beperkingen richt. De werkwijze maakt ongestoorde hechting van astrocyten op het abluminale membraanoppervlak, per evenwicht incubator voor langere tijd. Hierdoor wordt een gelijkmatige zaaien van astrocyten bereikt die barrière kwaliteit toeneemten minimaliseert basale doorlaatbaarheid verschillen tussen de inserts.

Aangezien het gebruik van menselijke cellen is belangrijk voor het menselijk-relevant onderzoek ^21, we bovendien aantonen in dit artikel het specifieke gebruik van een nieuwe combinatie van primaire menselijke Becs en onsterfelijke, menselijke astrocyten voor de oprichting van een contact menselijk BBB-model met een high throughput screening capaciteit . Sinds het bekijken van cellen op poreuze membranen kan moeilijk zijn, we ook detail kleuring technieken die kunnen helpen bij het bepalen van samenloop en cel morfologie op de poreuze membranen. Tenslotte hebben we een voorbeeld hoe onze menselijke BBB model kan worden gebruikt om het effect van weefsel-type plasminogeen activator (t-PA) onderzoeken – een stolsel busting enzym dat als enige behandelingsoptie voor acute ischemische beroerte – de BBB.

Protocol

1. Cell Culture (3-7 dagen voor BBB Vergadering) 1.1. Primaire Human Brain microvasculaire endotheelcellen (Becs) Becs werden commercieel verkregen. De cellen werden door Dispase dissociatie van normale menselijke hersenen cortex weefsel en ontvangen van doorgang 3 (<12 populatie verdubbelingen) bevroren. Substratum: Jas weefselkweek schepen met "Attachment Factor" volgens de instructies van de fabrikant. Onderhoudscel:…

Representative Results

Om menselijk contact BBB model moesten we SVGs en BEC op poreuze membranen cultiveren met een 3 micrometer poriegrootte, aangetoond passage van astrocyten end-voeten mogelijk voor contact met endotheelcellen 14,15,27,28 stellen. Een schematische weergave van de volledige contactmodel wordt geïllustreerd in figuur 1 (linker afbeelding). De belangrijkste technische uitdaging van een contactsysteem is de noodzaak om astrocyten zaad tegen de zwaartekracht op het abluminale oppervlak van het memb…

Discussion

Medisch onderzoek naar hersenen pathologieën lijdt veel translationeel moeite. Op het gebied van acute ischemische beroerte, bijvoorbeeld veel geneesmiddelen die grote belofte in diermodellen bleek niet in de kliniek ^38,39. De redenen voor deze teleurstellende resultaten zijn divers en omvatten ontrouw van de preklinische testsystemen om de menselijke beroerte scenario en overwaardering van de resultaten verkregen uit dierproeven ^21. Een strategie om de voorspellende waarde van preklinische bevind…

Materials

Attachment Factor	Cell-Systems Corporation	4Z0-210
Brain microvascular endothelial cells (BECs), primary, human	Cell-Systems Corporation	ACBRI 376
Complete medium	Cell-Systems Corporation	4Z0-500	Supplemented with CSC JetFuel
Complete serum-free medium	Cell-Systems Corporation	SF-4Z0-500	Supplemented with CSC RocketFue
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES	Life Technologies	11330-032
Endothelial cells growth supplement (from bovine origin)	Sigma-Aldrich	E2759-15MG
External silicone tubing	Watson-Marlow	913.A080.016	Pumpsil brand, 8 mm internal diameter, 1.6 mm wall
Foetal calf serum	Lonza	14-501F
Gentamycin sulfate	Life Technologies	15750-060
Heparin sodium	Pfizer		1,000 U/ml
Hexamethyldisilazane (HMDS)	Sigma-Aldrich	H4875
Human brain microvascular endothelial cells	Cell-Systems Corporation	ACBRI 376
Internal silicone tubing	Watson-Marlow	913.A032.016	Pumpsil brand, 3.2 mm internal diameter, 1.6 mm wall
L-Glutamine	Life Technologies	25030
Mayer’s hematoxylin solution	Amber Scientific	MH
Minimum essential medium with Earle’s balanced salt solution	HyClone Laboratories	SH30244.01
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15140
Rat collagen I	Trevigen	3440-100-01	Cultrex brand
Tissue culture inserts	Corning Life Sciences	3472	Transwell brand, 6.5 mm in diameter, with polyester porous membrane, 3 µm pore-size