Método mejorado para la preparación de una base de células, Contacto Modelo Humano de la barrera hematoencefálica

Summary

Establecimiento de modelos humanos de la barrera sangre-cerebro (BBB) ​​puede beneficiar a la investigación de las condiciones del cerebro asociadas con la acreditación fracaso. Se describe aquí una técnica mejorada para la preparación de un modelo de acreditación de contacto, que permite que el cocultivo de astrocitos humanos y las células endoteliales del cerebro en los lados opuestos de una membrana porosa.

Abstract

La barrera sangre-cerebro (BBB) ​​comprende impermeables pero adaptables capilares del cerebro que controlan estrechamente el medio ambiente cerebro. El fallo de la BBB ha sido implicado en la etiología de muchas patologías cerebrales, creando una necesidad para el desarrollo de humano en modelos in vitro de BBB para ayudar en la investigación clínica relevante. Entre los numerosos modelos de BBB descritas hasta ahora, una estática (sin flujo), en contacto con la acreditación modelo, donde los astrocitos y las células endoteliales del cerebro (BEC) se co-cultivaron en los lados opuestos de una membrana porosa, surgió como un sistema todavía auténtica simplificado para simular el acreditación con capacidad de cribado de alto rendimiento. Sin embargo, la generación de dicho modelo presenta unos desafíos técnicos. Aquí se describe un protocolo para la preparación de un modelo de acreditación contacto humano que utiliza una combinación nueva de BEC humanos primarios y astrocitos humanos inmortalizados. Concretamente, se detalla un método innovador para la célula-siembra en inserciones invertidas, así como especificar la insercióntécnicas y tinción camisetas ejemplifican cómo usamos nuestro modelo para la investigación relacionada con la acreditación.

Introduction

La acreditación es una interfaz especializada entre la circulación de la sangre periférica y el sistema nervioso central, de manera crucial responsable del mantenimiento de la hemostasia cerebro. Se compone de células cerebrales distintas endoteliales microvasculares (BEC) que son funcionalmente influenciada por pocos componentes celulares y acelulares (a continuación) para formar una puerta de entrada ajustado y dinámico en el cerebro. En condiciones fisiológicas la acreditación restringe el paso de las células sanguíneas, componentes del plasma y sustancias nocivas, todos potencialmente neurotóxico, en el cerebro. En paralelo, la acreditación intercambia selectivamente iones y nutrientes (glucosa y amino-ácidos) clave y los productos de desecho metabólicos entre el cerebro y la circulación para mantener con precisión el entorno de ^1,2 cerebro. En los últimos años cada vez es más evidente que el fallo de la BBB se produce en una variedad de patologías cerebrales crónicas, tales como enfermedades neurodegenerativas o relacionados con la inflamación (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer y multiple esclerosis, respectivamente) ^3, así como en condiciones agudas como accidente cerebrovascular isquémico ^4.

Las propiedades únicas de BBB de las células endoteliales del cerebro (BEC) se inducen en gran medida por su entorno cerebral ^5, y en particular por los astrocitos ^6,7. Hay una creciente comprensión de que otros tipos de células, tales como pericitos ^8, neuronas y microglia ^1,3, así como la membrana basal ^9, apoyan BEC y juntos forman una unidad funcional denominada "unidad neurovascular" (NVU), que al mismo tiempo parejas neuronal demandas metabólicas a sus capilares que suministran ^10.

La participación de la acreditación en situaciones patológicas subyace numerosos intentos de desarrollar modelos in vitro de BBB para ayudar en la investigación relacionada con la acreditación ^11,12. Estos modelos tienen como objetivo imitar lo más cerca posible in vivo características de BBB de acuerdo con el principio NVU. In vitro </em> modelos de BBB se basan generalmente en una monocapa de las BEC apretado nudo de formación (principalmente de bovino ^{13, 14} humana, de rata ^15, ratón ^16, y porcinos ^17,18 orígenes), cultivadas en una membrana porosa junto con astrocitos de apoyo (ampliamente revisado por Deli et al. 2005 ^11).

Los astrocitos pueden ser cultivadas en condiciones sin contacto en la parte inferior de un pocillo de cultivo tisular, separado de las BEC (cultivadas en la superficie superior de la membrana) por el medio de cultivo todavía la comunicación con las BEC a través de factores solubles ^16. En modelos más avanzados que mejor se asemejan a la estructura anatómica de la BBB in vivo, los astrocitos se mantienen en condiciones de contacto y se cultivaron directamente en el lado opuesto de la membrana en las proximidades de las BEC ^13,15,17 (Figura 1). Esta configuración permite el contacto físico entre BEC y astrocitos, establecido cuando el proyecto astrocitossus procesos a través de la membrana porosa. Es importante destacar que, para un verdadero contacto a producirse los poros debe ser ≥ 1μm de diámetro, desde astrocíticos-pies finales no pueden pasar a través de tamaños de poro más pequeños (es decir, 0,4 micras) ^14,15. En particular, los sistemas de contacto de BBB se demuestran en algunos estudios para ser superior a sus homólogos sin contacto con respecto a su resistencia eléctrica trans-endotelial (TEER) y los valores de permeabilidad del endotelio de diversos trazadores ^13,17,18. Una dimensión adicional de flujo de medios de comunicación se añadió recientemente en un número de modelos in vitro de BBB para aplicar fuerzas de cizallamiento al endotelio para más cerca de la simulación de la vasculatura del cerebro ^12,19.

Un obstáculo técnico a superar cuando se genera un modelo de contacto acreditación es la siembra de los astrocitos en contra de la gravedad sobre la superficie abluminal de la membrana porosa. Protocolos anteriores ^13,20, donde los astrocitos se sembraron en simplemente una gota de medios de comunicación en la parte superior de una eninserto verted, permitió veces sólo a corto siembra (es decir, 10 min ¹³ o 2 horas ²⁰⁾ que se encuentra en nuestras manos para ser insuficiente para la fijación celular adecuada. El uso de este método básico, un período más largo de fijación de astrocitos requiere un constante monitoreo de los insertos mediante la apertura frecuente de la incubadora (causar fluctuaciones en la temperatura, el pH y la humedad) y también es propensa a la siembra de células irregular debido a las fugas de los medios de comunicación a través de los poros, especialmente Si se emplean poros de más de 1 m.

Aquí se describe un protocolo general para la preparación de un modelo de contacto BBB. Nuestro procedimiento incluye un método alternativo para la célula-siembra en inserciones invertidas, que aborda las limitaciones mencionadas anteriormente. El método permite la adherencia sin perturbaciones de los astrocitos en la superficie de la membrana abluminal, en un incubador equilibrado, durante un período prolongado de tiempo. Como resultado, se consigue una siembra uniforme de los astrocitos que aumenta la calidad de barreray minimiza las variaciones de permeabilidad basales entre insertos.

A medida que el uso de células humanas es importante para la investigación humana correspondiente ^21, que, además demostramos en este artículo la utilización específica de una novedosa combinación de las BEC humanos primarios e inmortalizado astrocitos humanos para el establecimiento de un modelo de acreditación de contacto humano con una alta capacidad de rastreo de . Desde la visualización de las células en membranas porosas puede ser, nosotros también las técnicas de tinción de detalles difíciles que pueden ayudar en la determinación de la confluencia y la morfología de las células de las membranas porosas. Finalmente, se ejemplifican cómo nuestro modelo de acreditación humano puede ser utilizado para examinar el efecto de tipo activador del plasminógeno tisular (t-PA) – una enzima para disolver coágulos que sirve como una opción de tratamiento único para el accidente cerebrovascular isquémico agudo – en la acreditación.

Protocol

1. Cultivos Celulares (3-7 días antes de la acreditación de la Asamblea) 1.1. Primaria células cerebrales humanas endoteliales microvasculares (BEC) BEC se obtuvieron comercialmente. Las células fueron producidas por disociación dispasa de tejido normal corteza cerebral humana y presenten en estado congelado en el paso 3 (<12 duplicaciones de la población). Sustrato: vasos Escudo de cultivo de tejidos con "factor de unión" de …

Representative Results

Con el fin de establecer un modelo de contacto acreditación humana tuvimos que cultivar IVS y BEC en membranas porosas con un tamaño de poro de 3 micras, que se muestra para permitir el paso de astrocitos finales pies para el contacto con las células endoteliales 14,15,27,28. Una representación esquemática del modelo de contacto completa se ilustra en la Figura 1 (la ilustración de la izquierda). El principal desafío técnico presentado por un sistema de contacto es la necesidad de sem…

Discussion

La investigación médica en patologías cerebrales sufre mucha dificultad de traslación. En el área de accidente cerebrovascular isquémico agudo, por ejemplo, muchos fármacos que mostraron una gran promesa en modelos animales fallaron en la clínica ^38,39. Las razones de estos resultados decepcionantes son diversos e incluyen la infidelidad de los sistemas de pruebas preclínicas con el escenario de derrame cerebral humana y la exageración de los resultados obtenidos a partir de estudios en animales <su…

Materials

Attachment Factor	Cell-Systems Corporation	4Z0-210
Brain microvascular endothelial cells (BECs), primary, human	Cell-Systems Corporation	ACBRI 376
Complete medium	Cell-Systems Corporation	4Z0-500	Supplemented with CSC JetFuel
Complete serum-free medium	Cell-Systems Corporation	SF-4Z0-500	Supplemented with CSC RocketFue
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES	Life Technologies	11330-032
Endothelial cells growth supplement (from bovine origin)	Sigma-Aldrich	E2759-15MG
External silicone tubing	Watson-Marlow	913.A080.016	Pumpsil brand, 8 mm internal diameter, 1.6 mm wall
Foetal calf serum	Lonza	14-501F
Gentamycin sulfate	Life Technologies	15750-060
Heparin sodium	Pfizer		1,000 U/ml
Hexamethyldisilazane (HMDS)	Sigma-Aldrich	H4875
Human brain microvascular endothelial cells	Cell-Systems Corporation	ACBRI 376
Internal silicone tubing	Watson-Marlow	913.A032.016	Pumpsil brand, 3.2 mm internal diameter, 1.6 mm wall
L-Glutamine	Life Technologies	25030
Mayer’s hematoxylin solution	Amber Scientific	MH
Minimum essential medium with Earle’s balanced salt solution	HyClone Laboratories	SH30244.01
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15140
Rat collagen I	Trevigen	3440-100-01	Cultrex brand
Tissue culture inserts	Corning Life Sciences	3472	Transwell brand, 6.5 mm in diameter, with polyester porous membrane, 3 µm pore-size