Migliorata metodo per la preparazione di un cell-based, Contact modello umano della barriera sanguigna del cervello

Summary

Istituzione di modelli umani della barriera emato-encefalica (BBB) ​​può beneficiare la ricerca sulle condizioni del cervello connesse con il fallimento BBB. Descriviamo qui una tecnica migliorata per la preparazione di un modello BBB contatto, che consente coculturing di astrociti e cellule endoteliali cervello sui lati opposti di una membrana porosa.

Abstract

La barriera ematoencefalica (BBB) ​​comprende impermeabili ma adattabili capillari cerebrali che controllano saldamente l'ambiente cervello. Fallimento della BBB è stato implicato nell'eziologia di molte patologie cerebrali, creando la necessità di sviluppare umano in vitro BBB per assistere nella ricerca clinicamente rilevante. Tra i numerosi modelli BBB finora descritti, statica (assenza di flusso), contattare modello BBB, dove astrociti e cellule endoteliali cerebrali (BECS) vengono co-coltivate sui lati opposti di una membrana porosa, è emerso come un sistema ancora autentica semplificato per simulare l' BBB con elevato throughput capacità di screening. Tuttavia, la produzione di tale modello presenta alcune sfide tecniche. Qui, descriviamo un protocollo per la preparazione di un modello di BBB contatto umano utilizzando una nuova combinazione di BECs umani primari ed astrociti umani immortalati. In particolare, i dettagli di un metodo innovativo per la cella-semina su inserti rovesciati così come specificato inserit tecniche di colorazione e esemplificano come usiamo il nostro modello per la ricerca BBB-correlati.

Introduction

Il BBB è un'interfaccia specializzata tra la circolazione del sangue periferico e il sistema nervoso centrale, fondamentalmente responsabile del mantenimento dell'emostasi cervello. Esso comprende cerebrali cellule endoteliali microvascolari distinti (BECS) funzionalmente influenzato da pochi componenti cellulari e acellulari (sotto) per formare un gateway stretto e dinamico nel cervello. In condizioni fisiologiche la BBB limita il passaggio di cellule del sangue, componenti del plasma e sostanze nocive, tutti potenzialmente neurotossico, nel cervello. In parallelo, la BBB scambia selettivamente ioni principali e nutrienti (glucosio e amminoacidi) e dei prodotti di scarto del metabolismo tra il cervello e la circolazione di mantenere con precisione l'ambiente cervello ^1,2. Negli ultimi anni sta diventando evidente che fallimento della BBB verifica in una varietà di patologie cerebrali croniche, come le malattie neurodegenerative infiammatorie o anormalità (come morbo di Alzheimer e multiple sclerosi rispettivamente) ^3, nonché in condizioni acute come l'ictus ischemico ^4.

Le proprietà uniche BBB di cellule endoteliali cerebrali (BECS) sono in gran parte indotte dal loro ambiente cerebrale ^5, ed in particolare dagli astrociti ^6,7. Vi è una crescente comprensione che altri tipi di cellule, come i periciti ^8, neuroni e microglia ^1,3, così come la membrana basale ^9, supportano BECs e formano insieme una unità funzionale definita "unità neurovascolare" (NVU) che simultaneamente coppie neuronale richieste metaboliche ai loro capillari che riforniscono ^10.

Il coinvolgimento della BBB in situazioni patologiche alla base di numerosi tentativi di sviluppare modelli in vitro di BBB per aiutare nella ricerca di BBB-correlato ^11,12. Questi modelli mirano a simulare il più vicino possibile in vivo caratteristiche BBB secondo il principio NVU. In vitro </em> Modelli BBB genere si basano su un monostrato di BEC-tight-junction di formatura (principalmente da bovini ^13, umano ^{14, 15} ratto, topo ¹⁶ e suini ^17,18 origini), coltivate su una membrana porosa con astrociti di supporto (ampiamente recensione di Deli et al. 2005 ^11).

Astrociti possono essere coltivate in condizioni di non-contatto sul fondo di una coltura di tessuti e, separato da BECs (coltivate sulla superficie superiore della membrana) dal mezzo di coltura pur comunicanti BECs tramite fattori solubili ^16. In modelli più avanzati che meglio ricordano la struttura anatomica della BBB in vivo, astrociti sono mantenute in condizioni di contatto e coltivate direttamente sul lato opposto della membrana in prossimità BECs ^13,15,17 (Figura 1). Questa configurazione consente il contatto fisico tra BEC e astrociti, stabilita quando progetto astrocitiloro processi attraverso la membrana porosa. Importante, per un vero contatto a verificarsi i pori devono essere ≥ 1μm di diametro, dal momento che astrociti finali piedi non può passare attraverso dimensioni dei pori più piccoli (cioè 0,4 micron) ^14,15. In particolare, i sistemi di contatto BBB sono dimostrate in alcuni studi di essere superiore alle loro controparti non-contatto per quanto riguarda il loro trans-endoteliale resistenza elettrica (TEER) e valori di permeabilità endoteliali dei vari traccianti ^13,17,18. Un'ulteriore dimensione della portata media è stato recentemente inserito in una serie di modelli in vitro BBB per applicare forze di taglio all'endotelio più stretta simulazione del sistema vascolare cerebrale ^12,19.

Un ostacolo tecnico da superare nella generazione di un modello di contatto BBB è la semina di astrociti contro gravità sulla superficie abluminale della membrana porosa. Protocolli precedenti ^13,20, dove astrociti erano semplicemente seminate in una goccia di supporti in cima a unInserto convertito, ammesso volte solo a breve seeding (vale a dire 10 min ¹³ o 2 ore ^20), che sono stati trovati nelle nostre mani per essere insufficiente per l'adesione delle cellule corretta. Usando questo metodo di base, un periodo più lungo attacco astrociti richiede un monitoraggio costante degli inserti di frequente apertura dell'incubatore (causando sbalzi di temperatura, pH e umidità) ed è anche incline a semina delle cellule irregolare a causa di perdita di mezzi di comunicazione attraverso i pori, soprattutto se pori più grandi di 1 um sono impiegati.

Qui, descriviamo un protocollo generale per la preparazione di un modello di contatto BBB. La nostra procedura prevede un metodo alternativo per cellula-semina su inserti invertiti, che affronta le limitazioni di cui sopra. Il metodo permette di adesione indisturbata degli astrociti sulla superficie della membrana abluminale, in un incubatore equilibrata, per un periodo di tempo prolungato. Come risultato, una semina uniforme di astrociti si ottiene che aumenta la qualità barrierae riduce al minimo le variazioni di permeabilità basali tra inserti.

Come l'uso di cellule umane è importante per la ricerca umana rilevanti ^21, abbiamo inoltre dimostriamo in questo articolo l'utilizzo specifico di una nuova combinazione di BECs umani primari e immortalata astrociti umani per l'istituzione di un modello BBB contatto umano con un elevato throughput capacità di screening . Poiché la visualizzazione di cellule su membrane porose può essere difficile, abbiamo anche particolare tecniche di colorazione che possono aiutare a determinare la confluenza e la morfologia delle cellule sulle membrane porose. Infine, rappresentiamo come il nostro modello BBB umano può essere utilizzato per esaminare l'effetto del tessuto di tipo plasminogeno (t-PA) – un enzima trombolitico che serve come opzione di trattamento unico per l'ictus ischemico acuto – sul BBB.

Protocol

1. Colture Cellulari (3-7 giorni prima BBB Assembly) 1.1. Primarie cellule cerebrali umane endoteliali microvascolari (BEC) BECs stati ottenuti commercialmente. Le cellule sono state prodotte dalla dissociazione dispasi del normale tessuto corteccia cerebrale umana e purché congelati a passaggio 3 (<12 raddoppi popolazione). Substrato: navi Coat tessuto-coltura con "Fattore Allegato" secondo le istruzioni del produttore. <…

Representative Results

Al fine di stabilire un essere umano, modello di contatto BBB abbiamo dovuto coltivare SVG e BECs sulle membrane porose con un 3 micron pori di dimensioni, indicato per consentire il passaggio di astrociti finali piedi per il contatto con le cellule endoteliali 14,15,27,28. Una rappresentazione schematica del modello di contatto completo è illustrato nella Figura 1 (illustrazione a sinistra). La principale sfida tecnica presentata da un sistema di contatto è la necessità di inizializzare a…

Discussion

La ricerca medica in patologie cerebrali soffre molta difficoltà traslazionale. Nella zona di ictus ischemico acuto, per esempio, molti farmaci che hanno mostrato una grande promessa in modelli animali fallito alla clinica ^38,39. Le ragioni di questi risultati deludenti sono diversi e comprendono l'infedeltà dei sistemi di test preclinici per lo scenario tratto umano e sovrastima dei risultati ottenuti da studi su animali ^21. Una strategia per migliorare il valore predittivo dei risultati pre…

Materials

Attachment Factor	Cell-Systems Corporation	4Z0-210
Brain microvascular endothelial cells (BECs), primary, human	Cell-Systems Corporation	ACBRI 376
Complete medium	Cell-Systems Corporation	4Z0-500	Supplemented with CSC JetFuel
Complete serum-free medium	Cell-Systems Corporation	SF-4Z0-500	Supplemented with CSC RocketFue
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES	Life Technologies	11330-032
Endothelial cells growth supplement (from bovine origin)	Sigma-Aldrich	E2759-15MG
External silicone tubing	Watson-Marlow	913.A080.016	Pumpsil brand, 8 mm internal diameter, 1.6 mm wall
Foetal calf serum	Lonza	14-501F
Gentamycin sulfate	Life Technologies	15750-060
Heparin sodium	Pfizer		1,000 U/ml
Hexamethyldisilazane (HMDS)	Sigma-Aldrich	H4875
Human brain microvascular endothelial cells	Cell-Systems Corporation	ACBRI 376
Internal silicone tubing	Watson-Marlow	913.A032.016	Pumpsil brand, 3.2 mm internal diameter, 1.6 mm wall
L-Glutamine	Life Technologies	25030
Mayer’s hematoxylin solution	Amber Scientific	MH
Minimum essential medium with Earle’s balanced salt solution	HyClone Laboratories	SH30244.01
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15140
Rat collagen I	Trevigen	3440-100-01	Cultrex brand
Tissue culture inserts	Corning Life Sciences	3472	Transwell brand, 6.5 mm in diameter, with polyester porous membrane, 3 µm pore-size