Forbedret fremgangsmåte for fremstilling av en human cellebasert kontakt Model of the Blood-Brain Barrier

Summary

Etablering av humane modeller av blod-hjerne-barrieren (BBB) ​​kan dra nytte forskning på hjerne tilstander forbundet med BBB svikt. Vi beskriver her en forbedret teknikk for fremstilling av en kontakt BBB-modell, som tillater coculturing av humane astrocytter og hjerne endotelceller på hver sin side av en porøs membran.

Abstract

Den blod-hjerne-barrieren (BBB) ​​omfatter ugjennomtrengelige, men kan tilpasses hjernekapillærer som ligger tett styrer hjernen miljø. Unnlatelse av BBB har vært antydet i etiologien av mange hjernesykdommer, skaper et behov for utvikling av human in vitro BBB modeller for å bistå i klinisk relevant forskning. Blant de tallrike BBB modellene hittil er beskrevet, et statisk (uten strømning), kontakt BBB-modellen, hvor astrocytter og hjerne endotel celler (BECS) er cocultured på hver sin side av en porøs membran, dukket opp som en forenklet, men likevel autentisk system for å simulere BBB med høy gjennomstrømming screening kapasitet. Likevel generering av en slik modell presenterer noen tekniske utfordringer. Her beskriver vi en protokoll for utarbeidelse av en kontakt menneskelig BBB-modellen benytter en ny kombinasjon av primære humane Becs og udødelig menneskelige astrocytter. Vi har nærmere bestemt detalj en nyskapende fremgangsmåte for celle-seeding på omvendte innsatser så vel som spesifiserer innrykkett fargeteknikker og eksemplifisere hvordan vi bruker vår modell for BBB-relatert forskning.

Introduction

BBB er en spesialisert grensesnitt mellom det perifere blodsirkulasjonen og det sentrale nervesystemet, det avgjørende er ansvarlig for vedlikehold av hjernen hemostase. Det består av forskjellige hjerne mikrovaskulære endotelceller (BECS) som er funksjonsmessig påvirket av noen celle-og acellulære komponenter (nedenfor) for å danne en tett og dynamisk gateway inn i hjernen. Under fysiologiske betingelser BBB begrenser passasjen av blodceller, plasma-komponenter og skadelige stoffer, som alle potensielt nevrotoksisk, inn i hjernen. Parallelt BBB selektivt utveksler viktige ioner og næringsstoffer (glukose og aminosyrer med) og metabolske avfallsprodukter mellom hjernen og blodsirkulasjonen til nettopp å opprettholde hjernen miljøet ^1,2. I de senere år er det blitt klart at svikt av BBB forekommer i en rekke kroniske hjernesykdommer, for eksempel neurodegenerative og betennelsessykdommer (for eksempel Alzheimers sykdom og multiple sklerose, henholdsvis) ^3, så vel som i akutte tilstander som hjerneinfarkt ^4..

De unike egenskaper av BBB hjerne endotel celler (BECS) er i stor grad forårsaket av deres cerebral miljø ^5, og i særdeleshet ved astrocytter ^6,7. Det er en økende forståelse for at andre celletyper, for eksempel pericytes ^8, nevroner og microglia ^1,3, samt basalmembranen ^9, støtte Becs og danner sammen en funksjonell enhet kalt "neurovascular enhet" (NVU) som samtidig par nevronale metabolske krav til sine forsyne kapillærer ^10.

Involvering av BBB i patologiske situasjoner ligger under mange forsøk på å utvikle in vitro BBB modeller for å bistå i BBB-relatert forskning ^11,12. Disse modellene tar sikte på å etterligne så nært som mulig in vivo BBB egenskaper i henhold til NVU prinsippet. In vitro </em> BBB modeller generelt stole på en monolayer av stram-krysset dannende becs (hovedsakelig fra storfe ^13, menneskelig ^14, rotte ^15, mus ^16, og svin ^17,18 opprinnelse), dyrket på en porøs membran sammen med støtte astrocytter (utstrakt anmeldt av Deli et al. 2005 ^11).

Astrocytter kan dyrkes i ikke-kontaktforholdene på undersiden av et vevskultur godt separert fra BECS (dyrket på den øvre overflaten av membranen) av kulturmediet ennå kommuniserer med BECS via løselige faktorer ^16. I mer avanserte modeller som bedre ligner den anatomiske strukturen av BBB in vivo, er astrocytter opprettholdes i kontaktforhold og dyrket direkte på den motsatte side av membranen i nær tilknytning til BECS ^13,15,17 (fig. 1). Denne konfigurasjonen gjør det mulig fysisk kontakt mellom Becs og astrocytter, etablert når astrocytter prosjektderes prosesser gjennom den porøse membran. Viktigere, for en ekte kontakt for å oppstå porene bør være ≥ 1/iM i diameter, siden astrocytic slutt fot ikke kan passere gjennom mindre pore størrelser (dvs. 0,4 mikrometer) ^14,15. Spesielt, er kontakt BBB-systemer demonstrert i noen studier å være bedre enn sine ikke-kontakt kolleger om deres trans-endothelial elektrisk motstand (Teer) og endothelial permeabilitet verdier av ulike sporstoffer ^13,17,18. En ytterligere dimensjon av mediastrømmen nylig ble tilsatt i en rekke in vitro-modeller BBB å anvende skjærkrefter til endotelet for nærmere simulering av hjernens blodkar ^12,19.

En teknisk hindring for å overvinne ved generering av en kontakt BBB modellen er såing av astrocytter mot tyngdekraften på abluminal overflaten av den porøse membran. Tidligere protokoller ^13,20, hvor astrocytter ble bare seeded i en dråpe media på toppen av en iomregnet innsats, tillates kun kort seeding ganger (dvs. 10 min ¹³ eller 2 hr ²⁰⁾ som ble funnet i våre hender for å være utilstrekkelig for riktig celle vedlegg. Ved hjelp av denne grunnleggende metode, en lengre astrocyte feste periode krever konstant overvåking av innsatsene ved hyppig åpning av inkubator (forårsaker variasjoner i temperatur, pH og fuktighet), og er også utsatt for ujevn celle seeding grunn av lekkasje av mediet gjennom porene, særlig hvis porer større enn 1 pm blir anvendt.

Her beskriver vi en generell protokoll for utarbeidelse av en kontakt BBB modell. Vår prosedyre inkluderer en alternativ metode for celle-seeding på omvendte inserts, som omhandler de nevnte begrensninger. Fremgangsmåten gjør det mulig uforstyrret tilslutning av astrocytter på abluminal membranoverflaten, i en inkubator ekvilibrert, over en lengre tidsperiode. Som et resultat, er en enhetlig såing av astrocytter oppnådd som øker barrierekvalitetenog minimerer basal permeabilitet variasjoner mellom innsatser.

Etter hvert som bruken av humane celler er viktig for human-relevant forskning ^21, vi i tillegg viser i denne artikkelen den spesifikke anvendelse av en ny kombinasjon av primære humane BECS og udødeliggjort human astrocytter for opprettelse av en kontakt human BBB-modell med en høy gjennomløpsscreening kapasitet . Siden visning av celler på porøse membraner kan være vanskelige, har vi også detaljfargeteknikker som kan bistå i fastsettelse av samløpet og cellemorfologi på de porøse membraner. Endelig eksemplifisere vi hvordan vår human BBB-modellen kan bli anvendt for å undersøke effekten av tissue-type plasminogen-aktivator (t-PA) – en blodpropp spreng enzym som tjener som eneste behandling for akutt iskemisk hjerneslag – on BBB.

Protocol

En. Cell Culture (3-7 dager før BBB Assembly) 1.1. Primære Human Brain mikrovaskulær endotelceller (Becs) Becs ble kommersielt oppnådd. Cellene ble fremstilt ved dispase dissosiasjon av normal human hjerne cortex vev og gitt frosset på passasjen 3 (<12 populasjons fordoblinger). Grunnen: Coat vev-kultur fartøy med "Attachment Factor" i henhold til produsentens instruksjoner. Cell vedlikehold: Opprett BECS i s…

Representative Results

For å etablere et menneske, kontakt BBB modell vi måtte dyrke SVGs og BECS på porøse membraner med en 3 um pore-størrelse, er vist for å tillate passasje av astrocyte endeføtter for kontakt med endotelceller 14,15,27,28. En skjematisk fremstilling av den komplette kontakt modellen er illustrert i figur 1 (venstre figur). De viktigste tekniske utfordring med en kontakt-systemet er behovet for å frø astrocytter mot tyngdekraften på abluminal overflaten av membranen. Vi har lykkes i de…

Discussion

Medisinsk forskning på hjernesykdommer lider mye translasjonell vanskelighetsgrad. I området av akutt iskemisk hjerneslag, for eksempel, mange legemidler som viste store løftet i dyremodeller mislyktes på klinikken ^38,39. Årsakene til disse skuffende resultatene er variert og inkluderer utroskap av de prekliniske testsystemer for det menneskelige slag scenario og overvurdering av resultatene fra dyrestudier ^21. En strategi for å bedre prediktiv verdi på prekliniske funn til den kliniske fase…

Materials

Attachment Factor	Cell-Systems Corporation	4Z0-210
Brain microvascular endothelial cells (BECs), primary, human	Cell-Systems Corporation	ACBRI 376
Complete medium	Cell-Systems Corporation	4Z0-500	Supplemented with CSC JetFuel
Complete serum-free medium	Cell-Systems Corporation	SF-4Z0-500	Supplemented with CSC RocketFue
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES	Life Technologies	11330-032
Endothelial cells growth supplement (from bovine origin)	Sigma-Aldrich	E2759-15MG
External silicone tubing	Watson-Marlow	913.A080.016	Pumpsil brand, 8 mm internal diameter, 1.6 mm wall
Foetal calf serum	Lonza	14-501F
Gentamycin sulfate	Life Technologies	15750-060
Heparin sodium	Pfizer		1,000 U/ml
Hexamethyldisilazane (HMDS)	Sigma-Aldrich	H4875
Human brain microvascular endothelial cells	Cell-Systems Corporation	ACBRI 376
Internal silicone tubing	Watson-Marlow	913.A032.016	Pumpsil brand, 3.2 mm internal diameter, 1.6 mm wall
L-Glutamine	Life Technologies	25030
Mayer’s hematoxylin solution	Amber Scientific	MH
Minimum essential medium with Earle’s balanced salt solution	HyClone Laboratories	SH30244.01
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15140
Rat collagen I	Trevigen	3440-100-01	Cultrex brand
Tissue culture inserts	Corning Life Sciences	3472	Transwell brand, 6.5 mm in diameter, with polyester porous membrane, 3 µm pore-size