Förbättrad metod för framställning av en human cellbaserad, Kontakta modell av blod-hjärnbarriären

Summary

Inrättande av mänskliga modeller av blod-hjärnbarriären (BBB) ​​kan gynna forskning om hjärnans villkor förknippade med BBB misslyckande. Vi beskriver här en förbättrad teknik för framställning av ett kontakt BBB-modell, som tillåter samodling av humana astrocyter och hjärna endotelceller på motsatta sidor av ett poröst membran.

Abstract

Blod-hjärnbarriären (BBB) ​​innefattar ogenomträngliga men anpassnings hjärnkapillärerna som är tätt styr hjärnans miljö. Fel på BBB har antytts i etiologin för många hjärn sjukdomar, skapar ett behov av utveckling av human in vitro BBB: modeller för att hjälpa till kliniskt relevant forskning. Bland de talrika BBB: modeller som hittills beskrivits, en statisk (utan flöde), kontaktar BBB-modellen, där astrocyter och hjärna endotelceller (BEC) är samodlades på motsatta sidor av ett poröst membran, framträdde som ett förenklat ännu giltiga system för att simulera BBB med hög throughput screening kapacitet. Trots den generation av modellen innebär några tekniska utmaningar. Här beskriver vi ett protokoll för framställningen av en kontakt humant BBB-modell med användning av en ny kombination av primära humana BEC och immortaliserade humana astrocyter. Specifikt vi detalj en innovativ metod för cellsådd på inverterade insatser samt ange INSERt färgningsteknik och exemplifiera hur vi använder vår modell för BBB-relaterad forskning.

Introduction

Den BBB är en specialiserad gränssnitt mellan den perifera blodcirkulationen och det centrala nervsystemet, ytterst ansvarig för underhåll av hjärn hemostas. Den innefattar distinkt hjärn mikrovaskulära endotelceller (BEC), vilka funktionellt är påverkade av några cellulära och acellulära komponenter (nedan) för att bilda en tät och dynamisk gateway in i hjärnan. Under fysiologiska förhållanden BBB begränsar passagen av blodceller, plasmakomponenter och skadliga ämnen, som alla potentiellt neurotoxiska, in i hjärnan. Samtidigt byter den BBB selektivt viktiga joner och näringsämnen (glukos och aminosyror) och metaboliska avfallsprodukter mellan hjärnan och cirkulationen att exakt hålla hjärnan miljön ^1,2. På senare år har det blivit uppenbart att fel på BBB förekommer i en rad olika kroniska hjärn sjukdomar såsom neurodegenerativa eller inflammationsrelaterade sjukdomar (t.ex. Alzheimers sjukdom och multiple skleros, respektive) ^3, samt vid akuta tillstånd som ischemisk stroke ^4.

De unika BBB: egenskaperna för hjärnans endotelceller (BEC) till stor del framkallas av sin hjärn miljö ^5, och i synnerhet av astrocyter ^6,7. Det finns en växande insikt om att andra celltyper, såsom pericyter ^8, neuroner och mikroglia ^1,3 samt basalmembranet ^9, stötta BEC och tillsammans bildar en funktionell enhet benämnd "neurovaskulära apparat" (NVU) som samtidigt par neuronala metaboliska krav till sina levererar kapillärer ^10.

Medverkan av BBB i patologiska situationer ligger bakom många försök att utveckla in vitro BBB: modeller för att hjälpa till BBB-relaterad forskning ^11,12. Dessa modeller syftar till att härma så nära som möjligt in vivo BBB: egenskaper enligt NVU princip. In vitro </em> BBB: modeller bygger i allmänhet på ett monolager av tät-junction bildande BEC (främst från nötkreatur ^13, människa ^14, råtta ^15, mus ^16, och svin ^17,18 ursprung), odlade på ett poröst membran tillsammans med stödjande astrocyter (utför granskats av Deli et al. 2005 ^11).

Astrocyter kan odlas i icke-kontaktförhållanden på botten av en vävnadsodlingsbrunn, skild från BEC (som odlats på den övre ytan av membranet) av odlingsmediet ännu kommunicerar med BEC via lösliga faktorer ^16. I mer avancerade modeller som bättre liknar den anatomiska strukturen av BBB in vivo, är astrocyter bibehålls i kontaktbetingelser och odlades direkt på den motsatta sidan av membranet i nära anslutning till BEC ^13,15,17 (figur 1). Denna konfiguration gör att fysisk kontakt mellan BEC och astrocyter, upprättas när astrocyter projektsina processer genom det porösa membranet. Viktigt är att för en sann kontakt inträffa porerna bör ≥ 1 um i diameter, eftersom astrocytiska slut fötter inte kan passera genom mindre porstorlekar (dvs. 0,4 ^ m) ^14,15. Noterbart är kontakt BBB: system visats i några studier att vara överlägsna sina beröringsfria motsvarigheter om deras trans endothelial elektriskt motstånd (TEER) och endothelial permeabilitetsvärden av olika spårämnen ^13,17,18. En ytterligare dimension av medieflödet har nyligen lagts i ett antal in vitro-BBB: modeller för att tillämpa skjuvkrafter till endotelet för närmare simulering av hjärnans vaskulatur ^12,19.

Ett tekniskt hinder att övervinna när alstring av en kontakt BBB modell är odling av astrocyter mot tyngdkraften på den abluminala ytan av det porösa membranet. Tidigare protokoll ^13,20, där astrocyter helt enkelt seedade i en droppe media ovanpå en iomvandlas insats, tillåts endast korta sådd tider (dvs. 10 min ¹³ eller 2 tim ²⁰⁾ som fanns i våra händer för att vara otillräckligt för korrekt cellbindning. Med hjälp av denna grundläggande metod, kräver en längre astrocyternas fästperiod konstant övervakning av insatserna genom frekvent öppning av inkubatorn (orsakar variationer i temperatur, pH och fuktighet) och är också benägna att ojämn cell sådd på grund av läckage av media genom porerna, särskilt om porer större än 1 mikrometer används.

Här beskriver vi ett allmänt protokoll för framställning av ett kontakt BBB modell. Vår procedur innehåller en alternativ metod för cellsådd på inverterade insatser, som rör de ovan nämnda begränsningar. Förfarandet medger ostörd vidhäftning av astrocyter på abluminala membranytan, i en jämviktad inkubator under en utsträckt tidsperiod. Som ett resultat, är en likformig ympning av astrocyter kommas vilket ökar barriärkvalitetoch minimerar basala permeabilitet variationer mellan skären.

Eftersom användningen av mänskliga celler är viktigt för mänsklig-relevant forskning ^21, vi dessutom visa i denna artikel den specifika användningen av en ny kombination av primära humana BEC och förevigat mänskliga astrocyter för inrättandet av en kontakt mänsklig BBB-modell med en hög throughput screening kapacitet . Eftersom visning av celler på porösa membran kan vara svårt, vi också detalj färgningsteknik som kan bistå i fastställandet av sammanflöde och cellmorfologi på porösa membran. Slutligen, vi exemplifiera hur vår mänskliga BBB-modellen kan användas för att undersöka effekten av vävnad plasminogenaktivator (t-PA) – en koagulering busting enzym som fungerar som ett enda behandlingsalternativ för akut ischemisk stroke – på BBB.

Protocol

1. Cell Culture (3-7 dagar före till BBB Assembly) 1,1. Primära Human Brain mikrovaskulära endotelceller (BEC) BEC var kommersiellt erhållas. Cellerna producerade av dispas dissociation av normala mänskliga hjärnan cortex vävnad och förutsatt frysta vid passage 3 (<12 populationsfördubblingar). Substratum: Coat vävnadsodlingskärl med "Attachment Factor" enligt tillverkarens instruktioner. Cell underhåll:</em…

Representative Results

För att skapa en människa, kontakta BBB-modell som vi var tvungna att odla SVGs och BEC på porösa membran med en 3 ìm porstorlek, visat att medge passage av astrocyternas slut fötter för kontakt med endotelceller 14,15,27,28. En schematisk representation av den kompletta kontakt modellen illustreras i Figur 1 (vänster bild). Den största tekniska utmaningen presenteras av ett kontaktsystem är behovet av att seeda astrocyter mot tyngdkraften på abluminala membranets yta. Vi har lycka…

Discussion

Medicinsk forskning om hjärnans sjukdomar lider mycket translationell svårigheter. Inom området akut ischemisk stroke, till exempel många läkemedel som visade mycket lovande i djurmodeller misslyckades på kliniken ^38,39. Orsakerna till dessa nedslående resultat är varierande och innefattar otrohet av de prekliniska testsystem till den mänskliga stroke scenariot och överskattning av resultat från djurstudier ^21. En strategi för att förbättra det prediktiva värdet av prekliniska result…

Materials

Attachment Factor	Cell-Systems Corporation	4Z0-210
Brain microvascular endothelial cells (BECs), primary, human	Cell-Systems Corporation	ACBRI 376
Complete medium	Cell-Systems Corporation	4Z0-500	Supplemented with CSC JetFuel
Complete serum-free medium	Cell-Systems Corporation	SF-4Z0-500	Supplemented with CSC RocketFue
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES	Life Technologies	11330-032
Endothelial cells growth supplement (from bovine origin)	Sigma-Aldrich	E2759-15MG
External silicone tubing	Watson-Marlow	913.A080.016	Pumpsil brand, 8 mm internal diameter, 1.6 mm wall
Foetal calf serum	Lonza	14-501F
Gentamycin sulfate	Life Technologies	15750-060
Heparin sodium	Pfizer		1,000 U/ml
Hexamethyldisilazane (HMDS)	Sigma-Aldrich	H4875
Human brain microvascular endothelial cells	Cell-Systems Corporation	ACBRI 376
Internal silicone tubing	Watson-Marlow	913.A032.016	Pumpsil brand, 3.2 mm internal diameter, 1.6 mm wall
L-Glutamine	Life Technologies	25030
Mayer’s hematoxylin solution	Amber Scientific	MH
Minimum essential medium with Earle’s balanced salt solution	HyClone Laboratories	SH30244.01
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15140
Rat collagen I	Trevigen	3440-100-01	Cultrex brand
Tissue culture inserts	Corning Life Sciences	3472	Transwell brand, 6.5 mm in diameter, with polyester porous membrane, 3 µm pore-size