Autonoom Bioluminescente zoogdiercellen voor continue en real-time monitoring van de cytotoxiciteit
Summary
Zoogdierlijke cellen die het bacteriële bioluminescentie gencassette (<em> Lux</em>) Produceren licht autonoom. De resulterende bioluminescente dynamieken chemische belasting is aangetoond dat de behandeling effecten op celgroei en metabolisme weerspiegelen, waardoor deze cellen een goedkoop, continu real-time toxiciteit screening instrument dat gemakkelijk kan worden aangepast voor high-throughput automatisering.
Abstract
Zoogdiercel gebaseerde in vitro assays zijn alom toegepast als alternatieven voor dierproeven voor toxicologische studies, maar zijn beperkt door de hoge monetaire en tijd kosten parallelle monstervoorbereiding die noodzakelijk vanwege het destructieve karakter van vuurvlieg luciferase gebaseerde screeningswerkwijzen . Deze video beschrijft het gebruik van autonoom bioluminescent zoogdiercellen, die niet van de destructieve toevoeging van luciferine substraat als een goedkope en gemakkelijke werkwijze voor het bewaken van de cytotoxische effecten van een verbinding van interesse. Zoogdiercellen stabiel tot expressie volledige bacteriële bioluminescentie (luxCDABEfrp) gencassette autonoom produceren van een optisch signaal dat pieken bij 490 nm zonder toevoeging van een dure en mogelijk storende luciferine substraat excitatie door een externe energiebron, of vernietiging van het monster die traditioneel uitgevoerd bij optische beeldopnames. Deze onafhankelijkheid van externe stimulatie legt de last voor het handhaven van de bioluminescente reactie op de enkele cel, hetgeen betekent dat het resulterende signaal alleen wordt gedetecteerd tijdens actieve stofwisseling. Deze eigenschap maakt het lux-expressie cellijn een uitstekende kandidaat voor gebruik als biosentinel tegen cytotoxische effecten omdat veranderingen in bioluminescent productie wijzen op negatieve effecten op celgroei en metabolisme. Ook de autonome karakter en het ontbreken van de vereiste monster vernietiging toelaat herhaalde beeldvorming van hetzelfde monster in real-time gedurende de periode van blootstelling toxisch en kan over meerdere monsters met behulp van bestaande beeldvormende apparatuur op een geautomatiseerde manier worden uitgevoerd.
Introduction
In de VS, geneesmiddelen en andere producten voor menselijke consumptie bestemde vereisen uitgebreide evaluatie voordat ze worden goedgekeurd voor gebruik door de consument door de Food and Drug Administration. De financiële last voor het uitvoeren van deze tests is bovenaan de ontwikkelaar 1, die de kosten van de nieuwe compound ontwikkeling en dus aanzienlijk meer vertaalt in een hogere kosten voor de consument. Terwijl traditioneel veel van deze screening heeft proefdieren gebruikt om te fungeren als proxy's voor de menselijke gastheren, heeft dit bewezen een grote financiële last te zijn, met een geschatte $ 2800000000 jaarlijks besteed aan ADME / Tox (adsorptie, distributie, metabolisme, excretie en toxiciteit ) screening alleen 2 en steeds meer bewijs suggereert dat diermodellen niet betrouwbaar kunnen voorspellen humaantoxicologische reacties 3. Daarom is in vitro humane celkweek-based testing heeft aan populariteit gewonnen in de afgelopen twee decennia vanwege de relatief lagerekosten, hogere doorvoer en betere vertegenwoordiging van menselijke biologische beschikbaarheid en toxicologie 4. Voor celcultuur-toxiciteitstests screeningmethoden verschillende eindpunten, zoals het meten van ATP, het screenen van de activiteit van endogeen beschikbaar cytoplasmatische enzymen, sonderen van de integriteit van het celmembraan, of het bijhouden van het niveau van mitochondriale activiteit, cellulaire viabiliteit 5 , 6. Ongeacht het gekozen eindpunt deze werkwijzen vereisen alle de vernietiging van het monster voor metingen kunnen worden verricht, zodat enige producerende data op een tijdstip. Als gevolg hiervan, grote aantallen monsters moeten worden voorbereid en behandeld in parallel voor basis toxicologische kinetiek studies, opnieuw toe te voegen aan de kosten en de arbeid die nodig is voor de nieuwe compound ontwikkeling. Als alternatief testen met behulp van luciferase uitgescheiden zoals Gaussia luciferase 7, Vargula luciferase 8, en Metridia luciferase 9ontwikkeld die de behoefte aan cellysis elimineren en vereisen een fractie van de media eindpunt meting, maar deze zijn nog steeds beperkt tot bemonstering op vooraf bepaalde punten en ook de toevoeging van exogene substraten activerende licht vereisen.
Ten nadele van vereiste monster vernietiging en de kosten van substraten elimineren vermijden is een humane cellijn gemanipuleerd dat drukt de volledige bacteriële bioluminescentie (lux) gen cassette (luxCDABEfrp) om voor continue bewaking van levende cellen die vergelijkbaar aan fluorescente kleurstof-gebaseerde live cell imaging, maar zonder de extra foton-activerende en microscopisch onderzoek procedures. Deze cellijn kan constitutief produceren van een optisch signaal voor continue, directe detectie zonder de noodzaak van externe stimulatie, waardoor vernietiging van het monster te voorkomen. Mechanistisch, de lichtgevende signaal gegenereerd uit deze cellen leidens wanneer de luxAB gevormde luciferase-enzym katalyseert de oxidatie van een langketenige aldehyde (gesynthetiseerd en geregenereerd door de luxCDE genproducten met endogene substraten) in de aanwezigheid van verlaagde riboflavine fosfaat (FMNH 2, die gerecycleerd uit FMN de frp gen product) en moleculaire zuurstof 10. Expressie van de lux-cassette in de gastheercel kan ook licht te produceren en gedetecteerd zonder cellulaire vernietiging of exogeen substraatadditie. Ook de interactie tussen de lux genen en endogeen beschikbare FMN en O2 cosubstrates, en het vereiste van behoud van een omgeving die de omzetting van FMN tot FMNH 2 kan ondersteunen, zodat de resulterende bioluminescente signaal alleen worden waargenomen levende , metabool actieve cellen.
Deze eisen zijn eerder misbruikt om aan te tonen dat de lux-based bioluminescerende uitgang sterk correleert met cellulaire bevolking maat 11 en dat toxische verbinding blootstelling schaadt autobioluminescent productie in een dosis-response mode 12. Hier gebruiken we een eerder gekarakteriseerde autobioluminescent menselijke embryonale niercellen (HEK293) cellijn 11 de automatische toxicologische screening van antibiotica van de bleomycine familie met bekende DNA beschadigende activiteit als een representatief voorbeeld van de toepassing van autobioluminescent zoogdiercellen toxiciteit valideren tonen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze werkwijze toont het gebruik van autonoom bioluminescent zoogdiercellen als in vitro cytotoxiciteit screeningstest waarmee levende cellen continu worden gevolgd gedurende hun leven. Dit protocol is flexibel en kunnen worden aangepast aan specifieke experimentele omstandigheden geschikt als vereist. Bijvoorbeeld, de hier gepresenteerde experiment is geschikt voor het volgen van acute toxische effecten, maar kan worden aangepast aan traag of lange termijn effecten te evalueren door herhaaldelijk beeldvorming …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze onderzoeksinspanningen werden gesteund door de National Science Foundation gebied Chemische, Biotechniek, Milieu en Vervoer (CBET) Systemen onder award nummers CBET-0853780 en CBET-1159344 en de National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) onder award nummer 1R43ES022567-01, en het National Cancer Institute, Cancer beeldvormingsprogramma onder award nummer CA127745-01. De IVIS Lumina instrument gebruikt in dit werk werd verkregen van het Amerikaanse leger Defense University Research Instrumentatie Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comment |
| IVIS Lumina | PerkinElmer | Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used | |
| Living Imaging 2.0 | PerkinElmer | Newer updates of this software is available | |
| 75 cm2 cell culture treated flasks | Corning | 430641 | |
| 6-well tissue culture-treated plates | Costar | 07-200-83 | |
| Black 24-well plate | Greiner Bio-One | 662174 | 96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications |
| Phosphate buffered saline | Hyclone | SH30910 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), phenol red-free | Hyclone | SH30284 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH3091003 | |
| Nonessential amino acids, 100x | Life Technologies | 11140050 | |
| Antibiotic-antimycotic, 100x | Life Technologies | 15240062 | |
| Sodium pyruvate, 100mM | Life Technologies | 11360070 | |
| Zeocin, 100 mg/ml | Life Technologies | R25001 | |
| Tripsin, 0.05% | Life Technologies | 25300062 |
References
- U.S. Food and Drug Administration. Is it really FDA approved?. FDA Consumer Health Information. 2, (2009).
- Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
- Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regul. Toxicol. Pharmacol. 32, 56-67 (2000).
- Stacey, G. Current developments in cell culture technology. Adv. Exp. Med. Biol. 745, 1-13 (2012).
- Li, A. P. Screening for human ADME/Tox drug properties in drug discovery. Drug Discov. Today. 6, 357-366 (2001).
- Li, A. P. In vitro approaches to evaluate ADMET drug properties. Curr. Top. Med. Chem. 4, 701-706 (2004).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nat. Protoc. 4, 582-591 (2009).
- Thompson, E. M., Nagata, S., Tsuji, F. I. Cloning and expression of cDNA for the luciferase from the marine ostracod Vargula hilgendorfii. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 6567-6571 (1989).
- Lupold, S. E., Johnson, T., Chowdhury, W. H., Rodriguez, R. A real time Metridia luciferase based non-invasive reporter assay of mammalian cell viability and cytotoxicity via the beta-actin promoter and enhancer. PLoS ONE. 7, (2012).
- Meighen, E. A. Molecular biology of bacterial bioluminescence. Microbiol. Rev. 55, 123-142 (1991).
- Close, D. M., et al. Autonomous bioluminescent expression of the bacterial luciferase gene cassette (lux) in a mammalian cell line. PLoS ONE. 5, e12441 (2010).
- Close, D. M., Hahn, R. E., Ripp, S. A., Sayler, G. S. Determining toxicant bioavailability using a constitutively bioluminescent human cell line. , 1-4 (2011).
- Oliva-Trastoy, M., Defais, M., Larminat, F. Resistance to the antibiotic Zeocin by stable expression of the Sh ble gene does not fully suppress Zeocin-induced DNA cleavage in human cells. Mutagenesis. 20, 111-114 (2005).
- Close, D. M., Webb, J. D., Ripp, S. A., Patterson, S. S., Sayler, G. S. Remote detection of human toxicants in real time using a human optimized bioluminescent bacterial luciferase gene cassette bioreporter. Proc. SPIE 8371, Sensing Technologies for Global Health, Military Medicine, Disaster Response, and Environmental Monitoring II; and Biometric Technology for Human Identification IX. 837117, (2012).
- Close, D. M., Hahn, R. E., Patterson, S. S., Ripp, S. A., Sayler, G. S. Comparison of human optimized bacterial luciferase, firefly luciferase, and green fluorescent protein for continuous imaging of cell culture and animal models. J. Biomed. Opt. 16, e12441 (2011).
