Autonom Bioluminescent Säugerzellen für die kontinuierliche und Echtzeit-Überwachung von Zytotoxizität
Summary
Mammalian Zellen, die das bakterielle Biolumineszenz Genkassette (<em> Lux</em>) Erzeugen Licht autonom. Die resultierenden Biolumineszenz Dynamik bei Exposition gegenüber chemischen Stoffen haben nachgewiesen, dass die Behandlung Auswirkungen auf das Zellwachstum und den Stoffwechsel zu reflektieren, so dass diese Zellen eine kostengünstige, kontinuierliche, Echtzeit-Toxizität Screening-Tool, das leicht für High-Throughput-Automatisierung angepasst werden kann.
Abstract
Säugetier-Zell-basierten in vitro-Assays wurden weithin als Alternativen zu Tierversuchen für toxikologische Studien eingesetzt wurden dann aber wegen der hohen Geld-und Zeit Kosten parallel Probenvorbereitung, die aufgrund der destruktiven Natur der Glühwürmchen-Luciferase-basierte Screening-Verfahren notwendig sind begrenzt . Dieses Video beschreibt die Verwendung von autonom Biolumineszenz Säugerzellen, die keine die destruktive Addition eines Luciferinsubstrat als kostengünstige und einfache Methode zur Überwachung der zytotoxischen Wirkung einer Verbindung von Interesse. Säugerzellen stabil exprimieren, die vollständige Bakterien Biolumineszenz (luxCDABEfrp) Genkassette autonom erzeugt ein optisches Signal, das Peaks bei 490 nm ohne Zusatz eines teuren und möglicherweise störende Luciferinsubstrat, Anregung durch eine externe Energiequelle oder Zerstörung der Probe, die traditionell durchgeführt während der optischen Bildgebungsverfahrens. Diese Unabhängigkeit von externer Stimulation stellt die Belastung für die Aufrechterhaltung der Biolumineszenz-Reaktion lediglich auf der Zelle, so dass das resultierende Signal nur während des aktiven Metabolismus detektiert. Diese Eigenschaft macht das lux-exprimierenden Zelllinie ein ausgezeichneter Kandidat für die Verwendung als biosentinel gegen zytotoxische Effekte, da Änderungen in Biolumineszenz Produktion anzeigt nachteilige Auswirkungen auf das Zellwachstum und den Stoffwechsel sind. Ebenso ermöglicht die autonome Natur und der Mangel an erforderlichen Probe Zerstörung wiederholte Abbildung der gleichen Probe in Echtzeit während der gesamten Giftstoff Belichtung und können über mehrere Proben in einem der vorhandenen bildgebende Geräte in einer automatisierten Weise durchgeführt werden.
Introduction
In den USA benötigen Arzneimittel und andere Produkte für den menschlichen Verzehr bestimmt sind umfangreiche Einschätzung, bevor sie für den Verbraucher von der Food and Drug Administration genehmigt werden. Die finanzielle Belastung für die Durchführung dieser Tests auf den Entwickler 1, das im Wesentlichen die Kosten für neue Verbindung Entwicklung und somit führt zu erhöhten Kosten für den Verbraucher gegeben. Während traditionell viel von dieser Screening tierischen Patienten genutzt hat, um als Stellvertreter für den menschlichen Gastgeber fungieren, hat sich diese zu einer großen finanziellen Belastung werden, mit einem geschätzten $ 2800000000 jährlich aufgewendet auf ADME / Tox (Adsorption, Verteilung, Stoffwechsel, Ausscheidung und Toxizität ) Screening allein 2 und Montage Hinweise darauf, dass Tiermodellen nicht verlässlich vorhersagen humantoxikologischen Antworten 3. Daher wurde in vitro menschliche Zellkultur-basierten Tests Popularität in den letzten zwei Jahrzehnten wegen seiner relativ niedrigen gewonnenKosten, höheren Durchsatz und eine bessere Darstellung von menschlichen Bioverfügbarkeit und Toxikologie 4. Aktuelle Zellkultur-basierte Screening-Methoden beschäftigen Toxizität verschiedenen Endpunkten, wie die Messung der ATP-Spiegel, das Screening der Aktivität von endogen verfügbar zytoplasmatischen Enzyme, die Erforschung der Integrität der Zellmembran, oder die Verfolgung der Ebene der mitochondrialen Aktivität, zu evaluieren zellulären Lebensfähigkeit 5 , 6. Unabhängig von dem Endpunkt gewählt alle diese Verfahren erfordern die Zerstörung der Probe vor der Messung entnommen werden, wodurch nur Erzeugen von Daten in einem einzigen Zeitpunkt. Als Folge müssen eine große Anzahl von Proben vorbereitet zu sein und behandelt parallel zur grundlegenden toxikologischen Studien Kinetik, erneute Zugabe zu den Kosten und Arbeit für neue Verbindung Entwicklung erforderlich. Alternativ Assays mit Luziferase wie Gaussia Luciferase 7, Vargula Luciferase 8 und 9 Metridia Luciferase abgesondertentwickelt worden, die die Beseitigung der Notwendigkeit zur Zelllyse und einen Bruchteil der Medien für die Endpunktbestimmung, werden diese jedoch noch Abtastung zu vorbestimmten Zeitpunkten beschränkt und erfordern die Zugabe von exogenen lichtaktivierenden Substraten.
Um den Nachteil der erforderlichen Probe Zerstörung sowie die Kosten für die Beseitigung Substrate zu vermeiden, wurde eine menschliche Zelllinie entwickelt, dass drückt die volle bakterielle Biolumineszenz (lux) Gen-Kassette (luxCDABEfrp), die für die kontinuierliche Überwachung von lebenden Zellen, die ähnlich ist zu ermöglichen fluoreszierende Farbstoff-basierte Live Cell Imaging, aber ohne die zusätzlichen Photon-aktivierenden und mikroskopische Untersuchungsverfahren. Diese Zelllinie kann konstitutiv Erzeugen eines optischen Signals zur kontinuierlichen, direkten Nachweis ohne äußere Stimulation, wodurch die Zerstörung der Probe. Mechanistisch führen die Biolumineszenz-Signal aus diesen Zellen erzeugts, wenn die luxAB gebildete Enzym Luciferase katalysiert die Oxidation einer langkettigen Fettsäure Aldehyd (synthetisiert und von den luxCDE Genprodukte mit endogenen Substraten regeneriert) in Gegenwart von reduziertem Riboflavinphosphat (FMNH 2, die von FMN durch die FRP-Gens zurückgeführt Produkt) und molekularem Sauerstoff 10. Expression des lux-Kassette in der Wirtszelle ermöglicht somit Licht erzeugt und detektiert werden, ohne Zellzerstörung oder exogene Substratzugabe. Ebenso stellt die Interaktion zwischen den Genen und der lux endogen verfügbar FMN und O 2 Cosubstrate, und der Forderung nach Aufrechterhaltung einer Umgebung, die die Umwandlung von FMN zu FMNH 2 unterstützen kann, dass die resultierende Biolumineszenz-Signal kann nur von lebenden nachgewiesen werden , metabolisch aktiven Zellen.
Diese Anforderungen wurden bisher ausgenutzt werden, um die lux-bas demonstrierened bioluminescent Ausgang korreliert stark mit zellulären Bevölkerung Größe 11 und dieser toxischen Verbindung Exposition beeinträchtigt autobioluminescent Produktion in einer Dosis-Wirkungs-weise 12. Wir verwenden hier eine bisher dadurch autobioluminescent humane embryonale Nierenzellen (HEK293)-Zelle 11 an die automatisierte toxikologischen Screening eines Antibiotikums aus der Bleomycin Familie mit bekannten DNA-schädigenden Aktivität als ein repräsentatives Beispiel der Anwendung von autobioluminescent Säugetierzellen zur Toxizität validieren demonstrieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Verfahren zeigt die Verwendung von autonom Biolumineszenz Säugerzellen als ein in vitro-Zytotoxizität Screening-Assay, der lebende Zellen kontinuierlich über ihre Lebensdauer verfolgt werden kann. Dieses Protokoll ist flexibel und kann modifiziert werden, um spezielle experimentelle Bedingungen aufzunehmen, wie erforderlich. So stellte das Experiment hier eignet sich für die Verfolgung von akuten toxischen Wirkungen, kann aber angepasst träge oder langfristigen Auswirkungen durch wiederholtes Bildge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschungsarbeiten wurden von der National Science Foundation Division of Chemical, Bioengineering, Umwelt und Transport (CBET) Systeme unter award Zahlen CBET-0853780 und CBET-1159344 und die National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) unterstützt unter Verleihungsnummer 1R43ES022567-01, und dem National Cancer Institute, Cancer Imaging Program unter Verleihungsnummer CA127745-01. Die Lumina IVIS Instrument in dieser Arbeit verwendet wurde, von der US Army Defense University Research Instrumentation Programm erhalten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comment |
| IVIS Lumina | PerkinElmer | Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used | |
| Living Imaging 2.0 | PerkinElmer | Newer updates of this software is available | |
| 75 cm2 cell culture treated flasks | Corning | 430641 | |
| 6-well tissue culture-treated plates | Costar | 07-200-83 | |
| Black 24-well plate | Greiner Bio-One | 662174 | 96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications |
| Phosphate buffered saline | Hyclone | SH30910 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), phenol red-free | Hyclone | SH30284 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH3091003 | |
| Nonessential amino acids, 100x | Life Technologies | 11140050 | |
| Antibiotic-antimycotic, 100x | Life Technologies | 15240062 | |
| Sodium pyruvate, 100mM | Life Technologies | 11360070 | |
| Zeocin, 100 mg/ml | Life Technologies | R25001 | |
| Tripsin, 0.05% | Life Technologies | 25300062 |
References
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