Sitotoksisite Sürekli ve gerçek zamanlı izlenmesi için özerk Bioluminescent Memeli Hücre
Summary
Bakteriyel biyolüminesans gen kasetinin ifade eden memeli hücreleri (<em> Lux</em>) Özerk ışık üretirler. Kimyasal maruz kalma üzerine çıkan biyolüminesens dinamikleri bu hücrelerin kolayca yüksek verimli otomasyon için adapte edilebilir bir ucuz, sürekli, gerçek zamanlı toksisite tarama aracı yapma, hücresel büyüme ve metabolizma üzerindeki tedavi etkilerini yansıtacak şekilde gösterilmiştir.
Abstract
Memeli hücre tabanlı in vitro deneyleri yaygın olarak toksikolojik çalışmalar için hayvanlar üzerinde test alternatif olarak istihdam edilmiştir ama nedeniyle ateşböceği lusiferaz-tabanlı tarama yöntemlerinin yıkıcı doğası zorunlu paralel numune hazırlama, yüksek para ve zaman maliyetleri nedeniyle sınırlı kalmıştır . Bu video ilgi çekici bir bileşik olan sitotoksik etkilerinin izlenmesi için bir ucuz ve kolay bir yöntem olarak, bir lusiferin substratının yıkıcı ilave gerektirmeyen Bağımsız biyolüminesans memeli hücrelerinin kullanımını tarif etmektedir. Stabil bir şekilde tam bakteriyel biyolüminesans (luxCDABEfrp) geni ifade kaseti, memeli hücreleri bağımsız olarak bir optik sinyal üreten bir harici enerji kaynağı, ya da geleneksel bir numunenin tahrip edilmesi pahalı ve muhtemelen müdahale lusiferin substratının, uyarma ilavesi olmadan 490 nm pik optik görüntüleme işlemi sırasında yapılans. Dış stimülasyon gelen bu bağımsızlık çıkan sinyal sadece aktif metabolizma sırasında tespit, yani sadece hücre bioluminescent reaksiyon korumak için yük getirmektedir. Biyolüminesans üretiminde değişimler hücre büyümesi ve metabolizması üzerindeki olumsuz etkilerin bir göstergesi olduğundan, bu özellik, lux-eksprese eden hücre soyu sitotoksik etkilerine karşı biosentinel olarak kullanım için mükemmel bir aday yapar. Benzer bir şekilde, gerekli örnek imha özerk doğası ve eksikliği zehiri maruz kalma süresi boyunca gerçek zamanlı olarak aynı numune üzerinde tekrar görüntüleme izin verir ve otomatik bir şekilde mevcut görüntüleme ekipmanı kullanarak çoklu örnekler yardımıyla gerçekleştirilebilir.
Introduction
Onlar Gıda ve İlaç İdaresi tarafından tüketici kullanım için onaylanmıştır önce ABD'de, insan tüketimine yönelik ilaç ve diğer ürünleri kapsamlı bir değerlendirme gerektirir. Bu testinin yapılması için mali yük büyük ölçüde tüketiciler için artan maliyet yeni bileşik geliştirme ve bu nedenle çevirir maliyetini artırır geliştirici 1, yerleştirilir. Bu tarama geleneksel olarak çok insan ana için temsilci olarak vekaleten Hayvanlar üzerinde kullanılan olsa da, bu (Tox / ADME adsorpsiyon, dağılım, metabolizma, boşaltım ve toksisite her yıl harcanan yaklaşık 2800000000 $ ile, büyük bir mali yük olduğu kanıtlanmıştır ) Tek başına tarama 2 ve hayvan modellerinde güvenilir insan toksikolojik yanıtları 3 tahmin edemez düşündüren montaj kanıtlar. Bu nedenle, in vitro insan hücre kültürü tabanlı test nedeniyle nispeten daha düşük olan son yirmi yılda popülerlik kazanmıştırmaliyet, daha yüksek verim ve insan biyoyararlanım ve toksikoloji 4 daha iyi temsil. Mevcut hücre kültürü bazlı toksisite tarama yöntemleri hücre canlılığı 5 değerlendirmek için, hücresel membran bütünlüğünü sondalama veya mitokondriyal aktivite düzeyi izleme, endojen olarak mevcut sitoplazmik enzimlerin aktivitesinin taranması, örneğin ATP seviyelerinin ölçümü gibi, uç noktalar, istihdam , 6. Ölçümler ve böylece tek bir zaman noktasında veri üreten alınabilir önce Ancak, ne olursa olsun seçilen nokta dolayı, bu yöntemler her numunenin imha gerektirir. Sonuç olarak, çok sayıda numune hazırlanmış ve temel toksikolojik kinetik çalışmalar için paralel olarak tedavi, daha yeni bir bileşik geliştirilmesi için gerekli maliyet ve iş gücü ekleyerek olması gerekir. Alternatif olarak, bu tür tahliller kullanılarak Gaussia 7 lusiferaz, Vargula lusiferaz 8 ve 9 Metridia lusiferaz gibi lusiferaz salgılananhücre parçalama için olan ihtiyacı ortadan kaldırır ve son nokta ölçümü için, ortamın bir kısmını gerektirir, ancak, yine de bu önceden belirlenmiş zaman noktalarında, örnekleme ile sınırlıdır ve ayrıca dışsal ışık aktive edici yüzeyler ilavesi gerektiren geliştirilmiştir.
Örnek gerekli imha zararına yanı sıra substratlar maliyeti ortadan kaldırmak için önlemek için, bir insan hücre hattı benzer canlı hücreler sürekli olarak izlenmesi için izin vermek için tam bakteriyel biyolüminesans (lux) gen kasetinin (luxCDABEfrp) ifade eden tasarlandı floresan-boya tabanlı canlı hücre görüntüleme için, ancak ek foton-aktive edici ve mikroskobik inceleme prosedürler olmaksızın. Bu hücre hattı, böylece numunenin imha kaçınarak, yapısal olarak dış uyarılması için gerek olmaksızın sürekli, doğrudan saptanması için bir optik sinyal üretme yeteneğine sahiptir. Mekanik olarak, bu hücrelerden üretilen bioluminescent sinyal nedens luxAB şekillendirilmiş lusiferaz enzim indirgenmiş riboflavin fosfat varlığında (FRP geni tarafından FMN ikinci geri kazanılır FMNH 2, uzun zincirli bir yağ aldehid (endojen maddeleri kullanarak luxCDE gen ürünleri tarafından sentezlenen ve rejenere) oksidasyonunu katalize zaman ürün) ve moleküler oksijen 10. Konakçı hücre içinde, lux kaset ekspresyonu bu nedenle üretilen ve hücre yıkımı veya eksogen bir substrat ilave edilmeden tespit edilmesi ışık sağlar. Benzer şekilde, lux genler ve endojen olarak mevcut FMN ve O 2 cosubstrates ve FMNH 2 FMN dönüşüm destekleyen bir ortamın bakım gereksinimi, arasındaki etkileşim, elde edilen biyolüminesans sinyali sadece oturma tespit edilebilir olmasını sağlar , metabolik olarak aktif hücrelerin.
Bu gereksinimler daha önce o lüks-bas göstermek için istismar edilmiştired bioluminescent çıktı hücresel nüfus büyüklüğü 11 ve zehirli bileşik maruz kalma bir doz-yanıt moda 12 autobioluminescent üretim bozar ile güçlü ilişkilidir. Burada toksisite testi için autobioluminescent memeli hücrelerinin uygulama doğrulamak için temsili bir örnek olarak bilinen DNA hasarına aktivitesi ile bleomisin ailesinin bir antibiyotik otomatik toksikolojik tarama göstermek için, daha önce karakterize edilen autobioluminescent insan embriyonik böbrek (HEK293) hücre hattı 11 kullanır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yöntem, canlı hücreler sürekli olarak kullanım süresi boyunca takip edilmesine olanak in vitro sitotoksisite tarama deneyi, bir özerk olarak biyolüminesans memeli hücrelerinin kullanımını gösterir. Bu protokol, esnek ve gerektiğinde gibi belirli deney koşulları karşılamak için modifiye edilebilir. Örneğin, deney akut toksik etkilerini izleme için uygundur Burada yer ama art arda artan zaman aralıklarında (yani her 24 saat) görüntüleme ve arasında standart enküba…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma çabaları Kimya, Biyomühendislik, Çevre ve ödül numaraları CBET-0853780 ve CBET-1159344 ve Ulusal Sağlık Enstitüleri, Çevre Sağlığı Bilimleri Ulusal Enstitüsü (NIEHS) altında Transport (CBET) Sistemleri, Ulusal Bilim Vakfı Bölümü tarafından desteklenmiştir ödül sayısı 1R43ES022567-01 ve Ulusal Kanser Enstitüsü, ödül sayısı CA127745-01 altında Kanser Görüntüleme Programı kapsamında. Bu çalışmada kullanılan IVIS Lumina aracı ABD Ordusu Savunma Üniversitesi Araştırma Araçları Program elde edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comment |
| IVIS Lumina | PerkinElmer | Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used | |
| Living Imaging 2.0 | PerkinElmer | Newer updates of this software is available | |
| 75 cm2 cell culture treated flasks | Corning | 430641 | |
| 6-well tissue culture-treated plates | Costar | 07-200-83 | |
| Black 24-well plate | Greiner Bio-One | 662174 | 96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications |
| Phosphate buffered saline | Hyclone | SH30910 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), phenol red-free | Hyclone | SH30284 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH3091003 | |
| Nonessential amino acids, 100x | Life Technologies | 11140050 | |
| Antibiotic-antimycotic, 100x | Life Technologies | 15240062 | |
| Sodium pyruvate, 100mM | Life Technologies | 11360070 | |
| Zeocin, 100 mg/ml | Life Technologies | R25001 | |
| Tripsin, 0.05% | Life Technologies | 25300062 |
References
- U.S. Food and Drug Administration. Is it really FDA approved?. FDA Consumer Health Information. 2, (2009).
- Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
- Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regul. Toxicol. Pharmacol. 32, 56-67 (2000).
- Stacey, G. Current developments in cell culture technology. Adv. Exp. Med. Biol. 745, 1-13 (2012).
- Li, A. P. Screening for human ADME/Tox drug properties in drug discovery. Drug Discov. Today. 6, 357-366 (2001).
- Li, A. P. In vitro approaches to evaluate ADMET drug properties. Curr. Top. Med. Chem. 4, 701-706 (2004).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nat. Protoc. 4, 582-591 (2009).
- Thompson, E. M., Nagata, S., Tsuji, F. I. Cloning and expression of cDNA for the luciferase from the marine ostracod Vargula hilgendorfii. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 6567-6571 (1989).
- Lupold, S. E., Johnson, T., Chowdhury, W. H., Rodriguez, R. A real time Metridia luciferase based non-invasive reporter assay of mammalian cell viability and cytotoxicity via the beta-actin promoter and enhancer. PLoS ONE. 7, (2012).
- Meighen, E. A. Molecular biology of bacterial bioluminescence. Microbiol. Rev. 55, 123-142 (1991).
- Close, D. M., et al. Autonomous bioluminescent expression of the bacterial luciferase gene cassette (lux) in a mammalian cell line. PLoS ONE. 5, e12441 (2010).
- Close, D. M., Hahn, R. E., Ripp, S. A., Sayler, G. S. Determining toxicant bioavailability using a constitutively bioluminescent human cell line. , 1-4 (2011).
- Oliva-Trastoy, M., Defais, M., Larminat, F. Resistance to the antibiotic Zeocin by stable expression of the Sh ble gene does not fully suppress Zeocin-induced DNA cleavage in human cells. Mutagenesis. 20, 111-114 (2005).
- Close, D. M., Webb, J. D., Ripp, S. A., Patterson, S. S., Sayler, G. S. Remote detection of human toxicants in real time using a human optimized bioluminescent bacterial luciferase gene cassette bioreporter. Proc. SPIE 8371, Sensing Technologies for Global Health, Military Medicine, Disaster Response, and Environmental Monitoring II; and Biometric Technology for Human Identification IX. 837117, (2012).
- Close, D. M., Hahn, R. E., Patterson, S. S., Ripp, S. A., Sayler, G. S. Comparison of human optimized bacterial luciferase, firefly luciferase, and green fluorescent protein for continuous imaging of cell culture and animal models. J. Biomed. Opt. 16, e12441 (2011).
