Isolation des gouttelettes lipidiques cellulaires: deux techniques de purification partir de cellules de levure et placentas humains
Summary
Deux techniques pour isoler des gouttelettes lipidiques cellulaires à partir de 1) cellules de levure et 2) placentas humains sont présentés. L'élément central de ces deux procédés est centrifugation en gradient de densité, où la couche flottante résultant contenant les gouttelettes peuvent être facilement visualisés à l'oeil nu, on extrait et quantifié par analyse par transfert de Western pour la pureté.
Abstract
Les gouttelettes lipidiques sont des organites dynamiques qui peuvent être trouvés dans la plupart des cellules procaryotes eucaryotes et certaines. Structurellement, les gouttelettes sont constitués d'un noyau de lipides neutres entouré par une monocouche de phospholipides. Une des techniques les plus utiles pour déterminer les rôles cellulaires de gouttelettes a été identification protéomique des protéines liées, qui peuvent être isolées avec les gouttelettes. Ici, deux méthodes sont décrites pour isoler des gouttelettes lipidiques et leurs protéines liées de deux vastes eucaryotes: fission levure et les cellules des villosités placentaires humains. Bien que les deux techniques présentent des différences, la principale méthode – centrifugation en gradient de densité – est partagée par les deux préparations. Ceci démontre la grande applicabilité des techniques d'isolement de gouttelettes présentés.
Dans le premier protocole, des cellules de levure sont transformées en sphéroplastes par digestion enzymatique de leurs parois cellulaires. Les sphéroplastes résultants sont ensuite Gentment lysées dans un homogénéisateur ample. Ficoll est ajouté au lysat de fournir un gradient de densité, et le mélange est centrifugé trois fois. Après la première rotation, les gouttelettes lipidiques sont localisées sur la couche flottante de couleur blanche des tubes de centrifugeuse en même temps que le réticulum endoplasmique (RE), de la membrane plasmique, et vacuoles. Deux tours suivants sont utilisés pour enlever ces trois autres organites. Le résultat est une couche qui ne comporte que des gouttelettes et des protéines liées.
Dans le second protocole, les cellules des villosités placentaires sont isolés à partir de placentas à terme humain par digestion enzymatique à la trypsine et la DNase I. Les cellules sont homogénéisées dans un homogénéisateur ample. Étapes à basse vitesse et de centrifugation à vitesse moyenne sont utilisés pour éliminer les cellules intactes, des débris cellulaires, noyaux et des mitochondries. Le saccharose est ajouté à l'homogénat de fournir un gradient de densité et le mélange est centrifugé pour séparer les gouttelettes de lipides à partir de l'autre cellulafractions de r.
La pureté des gouttelettes lipidiques dans les deux protocoles est confirmée par analyse Western Blot. Les fractions de gouttelettes de deux préparations sont adaptés à l'analyse protéomique et lipidomiques ultérieure.
Introduction
Gouttelettes lipidiques sont des organites cellulaires dynamiques qui servent plusieurs fonctions dans les cellules. Ce sont des concentrateurs de stockage pour les lipides neutres, qui peuvent être converties en énergie ou utilisés pour la synthèse des phospholipides. Les gouttelettes jouent un rôle central dans des conditions physiologiques et pathologiques, y compris l'athérosclérose, l'obésité et les maladies métaboliques, ainsi que les maladies infectieuses 1,2. En outre, ils sont des sources intéressantes pour le biodiesel.
Beaucoup d'informations sur les rôles cellulaires de gouttelettes lipidiques a été obtenu à partir de l'analyse protéomique et lipidomiques de gouttelettes purifiés à partir d'organismes de grande envergure 3. Ces organismes ont inclus des bactéries, des levures 4,5 6-11, plantes 12,13, 14 nématodes et les mouches 15,16. Compte tenu de l'intérêt dans le rôle de gouttelettes lipidiques dans les maladies métaboliques de l'homme, les gouttelettes ont également été isolés à partir de cellules animales cultivées et untissus Nimal. Les lignées cellulaires cultivées ont inclus les adipocytes 3T3-L1, 17 ovariennes de hamster chinois (CHO) ou des cellules de K2 18, 19,20 hepatocyes humains et des lignées de cellules epitheliales 21. Les tissus animaux dont les gouttelettes ont été isolées ont inclus la souris muscle squelettique 22, 23 foie et les glandes mammaires 23. Comme mentionné ci-dessus, le but de la plupart des études d'isolement de gouttelettes est d'effectuer l'analyse protéomique sur les facteurs liés lipidomiques et analyse sur le neutre et les phospholipides.
Etant donné que les lipides neutres – les plus nombreux composants de gouttelettes lipidiques – sont moins denses que la plupart des autres matériaux cellulaires, l'isolement des gouttelettes a été traditionnellement effectuées en utilisant la centrifugation en gradient de densité. Cette technique est la pièce maîtresse des deux préparations présentées ici. Les techniques précédentes sont réunies et 6,24 modifiés dans une présentation visuelle de la séparation de gouttelettes à partir de cellules de levure de fission cultivéeset les cellules humaines noncultured obtenues à partir de tissu placentaire. L'objectif est de montrer la large applicabilité de cette technique en choisissant deux types de cellules très différentes comme points de départ pour l'isolement des gouttelettes. Cette technique devrait être utile pour ceux qui souhaitent isoler des gouttelettes de la plupart des organismes.
Protocole 1 décrit l'isolement de gouttelettes de lipides à partir de la levure à fission, Schizosaccharomyces pombe, qui a été utilisé comme modèle pour l'observation de la formation de gouttelettes au cours de la division cellulaire eucaryote 25. La levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae a été largement utilisée comme un organisme modèle pour l'étude de la biologie des gouttelettes de lipide. Protocole 1 est applicable à la fois aux organismes et les différences dans les préparatifs sont mis en évidence.
Protocole n ° 2 décrit l'isolation de gouttelettes de lipides à partir de cellules villeuses placentaires, qui sont à leur tour obtenu à partir de placentas humains à terme. Lacollection de placentas à terme offre une occasion unique d'obtenir en toute sécurité et éthique 200-250 g de tissu humain facilement disponibles 26, qui contient un nombre important de gouttelettes lipidiques. Ceci est en contraste avec la plupart des travaux d'isolation de gouttelettes de lipides chez les eucaryotes supérieurs, où les gouttelettes provenant de cellules cultivées. Dans ces études, les acides gras sont souvent ajoutés à la culture pour favoriser la synthèse des lipides neutres et donc la croissance de gouttelettes. Ceci est en contraste avec le travail ici où des gouttelettes lipidiques sont formées dans des conditions natives dans le tissu placentaire.
Les puretés des fractions lipidiques de gouttelettes sont déterminées par analyse par transfert de Western en utilisant des anticorps marqueurs organelles. Ces deux protocoles donneront lipidiques fractions de gouttelettes qui sont appropriés pour l'analyse protéomique et lipidomiques ultérieure.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les étapes critiques de ce protocole
Assurez-vous d'être cohérent avec les médias et les densités cellulaires au cours de la croissance des cellules en culture. Gouttelettes lipidiques cellulaires sont uniques que leurs protéines associées dépendent fortement de l'environnement dans lequel les cellules sont cultivées 17. Par conséquent, les médias, dans lequel les cellules sont cultivées et la densité des cellules doiven…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la récompense American Heart Association 13SDG14500046 à PD, une éducation à l'énergie durable et Centre de recherche Prix (Univ. du Tennessee) à PD, et par la formation médicale des médecins et la Fondation de recherche (Université de Tennessee) prix à JM Le auteurs remercient Caroline Leplante (Yale Univ.) pour le protocole pour convertir la levure à fission à sphéroplastes; Eric T. Boder (Univ. du Tennessee) pour l'usage de ses incubateurs, serrant la table centrifugeuse, et Western Blot équipement d'analyse et le Centre pour Biotechnologie de l'Environnement (Univ. Tennessee) pour l'utilisation de leur ultra-centrifugeuse; Günther Daum pour les anticorps de levure (Graz University of Technology, en Autriche.); le personnel du Département d'obstétrique et de gynécologie (Univ. Tennessee Medical Center) pour l'assistance technique .
Materials
| PROTOCOL #1: | |||
| 1.Growing yeast cells and converting to spheroplasts | |||
| Edinburgh Minimal Media (EMM) | Sunrise Science Products | 2005 | |
| Yeast extract with 5 supplements (YE5S) | Sunrise Science Products | 2011 | YE5S media with 225 mg/ml of each supplement: adeninie, histidine, leucine, lysine, uracil. The equivalent for budding yeast would be YPD. |
| YPD powder | Sunrise Science Products | 1875 | For S. cerevisiae |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | |
| Yeast Lytic Enzyme | MP Biomedicals | 215352610 | |
| Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum | Sigma-Aldrich | L1412 | |
| Zymolayse-20T | Sunrise Science Products | N0766391 | For S. cerevisiae |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D-3922 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 137115AM | |
| 1 liter glass bottle | |||
| 250 ml flask | |||
| 2.8 liter flasks | |||
| 2. Yeast lipid droplet isolation | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| Ficoll 400 | Fisher Scientific | BP525 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce Homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge Tubes 25x89mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Fiberlite* F15-6x100y Fixed-Angle Rotor | Thermo-Scientific | 75003698 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| PROTOCOL #2 | |||
| 1. Placental villous cells isolation | |||
| Disposable underpads | Fisher Scientific | 23666062 | |
| Autoclavable pan (container), 3L | Fisher Scientific | 1336110 | |
| Fine scissors, sharp-sharp, straight | Fine science tools | 1406011 | |
| London Forceps | Fine science tools | 1108002 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine science tools | 1127020 | |
| Razor blades | Fisher Scientific | S65921 | |
| Screen cup for CD-1 | Fisher Scientific | S1145 | |
| 40 mesh screen | Fisher Scientific | S0770 | |
| Fisherbrand cell stainers 100μm | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 150 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | NC9054771 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642 | |
| KCl | Fisher Scientific | P333 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P386 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| 2.5% trypsin 10x | Invitrogen | 15090046 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Roche Applied Science | 10104159001 | |
| Sodium bicarbonate solution | Sigma-aldrich | S8761 | |
| 500 ml Erlenmeyer flasks | |||
| 250 ml beakers | |||
| 15 ml centrifuge tubes | |||
| 10 ml serological pipettes | |||
| 50 ml centrifuge tubes | |||
| DMEM | Invitrogen | 11965084 | |
| 2. Lipid droplets isolation from villous placental cells | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220 | |
| Sodium Carbonate | Fisher Scientific | BP357 | |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge tubes 25x89mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| Ultra-Clear centrifuge tubes 14x89mm (for SW41) | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Disposable borosilicate glass pasteur pipets | Fisher Scientific | 1367820C | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biological safety hood | Thermo-Scientific | ||
| Waterbath | Fisher Scientific | ||
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| SW41 Ti Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 331336 | |
| Western blot | |||
| IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG | LI-COR | 926-68071 | dilution 1:15000 |
| IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG | LI-COR | 926-32210 | dilution 1:5000 |
| NuPAGE® Novex® 12% Bis-Tris gels | Invitrogen | NP0341 | |
| primary antibodies for PROTOCOL #1 | |||
| Erg6p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5000 |
| Dpm1p | Abcam | ab113686 | 4 μg/ml |
| Por1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5000 |
| Pma1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:10000 |
| Vma1p (anti-ATP6V1A) | Abcam | ab113745 | 0.5 μg/ml |
| primary antibodies for PROTOCOL #2 | |||
| perilipin 2 (anti-ADFP) | Abcam | ab52355 | 2 μg/ml |
| calnexin | Cell Signaling technology | 2679 | dilution 1:1000 |
| GM130 | Biorbyt | orb40533 | dilution 1:25 |
| COX IV | Cell Signaling technology | 4850 | dilution 1:1000 |
| MEK1 | Biorbyt | orb38775 | dilution 1:50 |
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