Isolamento de celulares lipídicas Gotas: Duas técnicas de purificação Começando a partir de células de levedura e placentas humanas
Summary
Duas técnicas de isolamento de gotículas lipídicas celulares a partir de 1) células de levedura e 2) placentas humanas estão apresentadas. A peça central de ambos os processos é a centrifugação de gradiente de densidade, onde a camada flutuante resultante contendo as gotículas podem ser facilmente visualizadas por olho, extraiu-se, e quantificada por análise de Western Blot quanto à pureza.
Abstract
Gotículas lipídicas são organelas dinâmicas que podem ser encontrados na maioria das células procariotas e eucariotas certos. Estruturalmente, as gotículas constituídas por um núcleo de lípidos neutros rodeadas por uma monocamada de fosfolipido. Uma das técnicas mais úteis na determinação dos papéis celulares de gotículas foi identificação proteoma de proteínas ligadas, que podem ser isolados, juntamente com as gotas. Aqui, dois métodos são descritos para isolar gotículas lipídicas e suas proteínas ligadas a partir de duas amplas eucariontes: levedura de fissão e as células das vilosidades da placenta humana. Apesar de ambas as técnicas têm diferenças, o método main – gradiente de densidade centrifugação – é compartilhado por ambas as preparações. Isto demonstra a ampla aplicabilidade das técnicas de isolamento de gotículas apresentados.
No primeiro protocolo, as células de levedura são convertidas em esferoplastos por digestão enzimática das paredes celulares. Os esferoplastos resultantes são então gently lisadas em um homogeneizador folgadas. Ficoll é adicionado ao lisado para providenciar um gradiente de densidade, e a mistura é centrifugada três vezes. Depois da primeira rotação, as gotículas lipídicas são localizadas na camada flutuante de cor branca dos tubos de centrífuga, juntamente com o retículo endoplasmático (ER), a membrana de plasma, e vacúolos. Dois rotações subsequentes são utilizados para remover estes três organelos. O resultado é uma camada que tem apenas gotículas e as proteínas ligadas.
No segundo protocolo, as células das vilosidades da placenta são isolados a partir de placenta humana prazo por digestão enzimática com tripsina e DNase I. As células são homogeneizadas num homogeneizador folgada. De baixa velocidade de centrifugação e de velocidade média passos são usadas para remover as células não quebradas, os detritos celulares, os núcleos, e as mitocôndrias. É adicionada sacarose ao homogenato para providenciar um gradiente de densidade, e a mistura é centrifugada para separar as gotículas lipídicas a partir do outro cellulafracções r.
A pureza das gotículas lipídicas em ambos os protocolos, é confirmada por análise Western Blot. As frações de gotículas de ambas as preparações são adequados para a análise proteômica e lipidomas subseqüente.
Introduction
Gotículas lipídicas celulares são organelas dinâmicas que servem múltiplas funções nas células. Eles são centros de armazenamento de lípidos neutros, que podem ser convertidas em energia ou utilizadas para a síntese de fosfolípidos. As gotículas de desempenhar um papel central em condições fisiológicas e patológicas, incluindo a aterosclerose, obesidade e doenças metabólicas relacionadas, e também as doenças infecciosas 1,2. Além disso, eles são fontes interessantes para combustíveis de biodiesel.
Muita informação sobre os papéis celulares de gotículas lipídicas foi obtida a partir de análise proteômica e lipidomas de gotículas purificados a partir de organismos de grande alcance 3. Estes organismos incluem as bactérias, levedura 4,5 6-11, plantas 12,13, nematóides 14, e voa 15,16. Dado o interesse no papel de gotículas lipídicas em doenças metabólicas humanos, as gotas foram também isolados a partir de células animais em cultura e umtecidos nimal. Linhas de células cultivadas têm incluído 3T3-L1 adipócitos 17, de ovário de hamster chinês (CHO), células K2 18, 19,20 hepatocyes humanos, e linhas de células epiteliais 21. Tecidos animais a partir do qual as gotas foram isolados incluíram rato músculo esquelético 22, fígado 23, e glândulas mamárias 23. Como mencionado acima, o objetivo da maioria dos estudos de isolamento gota é realizar análise proteômica sobre os fatores ligados e lipidomas no neutro e fosfolipídios.
Desde lipídios neutros – os mais numerosos componentes de gotículas lipídicas – são menos densos do que a maioria dos outros materiais celulares, o isolamento de gotículas tem sido tradicionalmente realizada usando gradiente de densidade centrifugação. Essa técnica é a peça central de ambas as preparações apresentadas aqui. As técnicas anteriores são combinados e 6,24 modificado para uma apresentação visual do isolamento de gotículas a partir de células de levedura de fissão cultivadase células humanas noncultured obtido a partir de tecido placentário. O objectivo é o de mostrar a ampla aplicabilidade desta técnica, escolhendo dois tipos de células muito diferentes de pontos para o isolamento a partir das gotículas. Esta técnica deve ser útil para aqueles que desejam isolar gotas da maioria dos organismos.
Protocolo 1 descreve o isolamento de gotículas lipídicas a partir da levedura de fissão, Schizosaccharomyces pombe, a qual tem sido utilizada como um modelo para observar a formação de gotículas durante a divisão celular eucariótica 25. A levedura Saccharomyces cerevisiae brotamento tem sido amplamente utilizado como organismo-modelo para estudar a biologia das gotículas de lípidos. Protocolo n ° 1 é aplicável a ambos os organismos e as diferenças nos preparativos são realçados.
Protocolo 2 descreve o isolamento de gotículas lipídicas de células das vilosidades da placenta, que são, por sua vez obtida a partir de placenta humana prazo. Ocoleção de placentas prazo proporciona uma oportunidade única de forma segura e eticamente obter 200-250 g de tecido humano prontamente disponível 26, que contém um número significativo de gotículas lipídicas. Isto está em contraste com a maior parte do trabalho de isolamento de gotículas de gordura em eucariotas superiores, onde as gotículas são originários a partir de células cultivadas. Nestes estudos, os ácidos gordos são, muitas vezes adicionado à cultura para promover a síntese de lípidos neutros e, assim, o crescimento de gotículas. Isto está em contraste com o trabalho aqui onde gotículas lipídicas são formadas sob condições nativas no tecido placentário.
As purezas das fracções de gotículas de lípido são determinados por análise de Western Blot, utilizando anticorpos de marcadores de organelos. Estes dois protocolos irá produzir fracções de gotículas lipídicas que são adequados para análise proteómica e lipidomas subsequente.
Protocol
Representative Results
Discussion
As etapas críticas dentro deste protocolo
Certifique-se para ser consistente com os meios e as densidades celulares durante o crescimento das células em cultura. Gotículas lipídicas celulares são únicos na medida em que as suas proteínas associadas são altamente dependentes do ambiente no qual as células são cultivadas 17. Portanto, os meios de comunicação em que as células são cultivadas e da densidade das células devem ser c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo prêmio American Heart Association 13SDG14500046 para PD, uma Educação Energia Sustentável & Centro de Pesquisa Award (Univ. of Tennessee) para PD, e de Educação Médica dos Médicos e Fundação de Pesquisa (Univ. of Tennessee) prêmio para JM A autores agradecem Caroline Leplante (Yale Univ.) para o protocolo para a conversão de levedura para esferoplastos; Eric T. Boder (Univ. of Tennessee) para o uso de suas incubadoras agitação, mesa centrífuga e Western Blot equipamentos de análise, e do Centro de Biotecnologia Ambiental (Univ. Tennessee) para o uso de seu ultra-centrífuga; Günther Daum para anticorpos levedura (Graz Univ of Technology, na Áustria.); o pessoal do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia (Univ. Tennessee Medical Center) para assistência técnica .
Materials
| PROTOCOL #1: | |||
| 1.Growing yeast cells and converting to spheroplasts | |||
| Edinburgh Minimal Media (EMM) | Sunrise Science Products | 2005 | |
| Yeast extract with 5 supplements (YE5S) | Sunrise Science Products | 2011 | YE5S media with 225 mg/ml of each supplement: adeninie, histidine, leucine, lysine, uracil. The equivalent for budding yeast would be YPD. |
| YPD powder | Sunrise Science Products | 1875 | For S. cerevisiae |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | |
| Yeast Lytic Enzyme | MP Biomedicals | 215352610 | |
| Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum | Sigma-Aldrich | L1412 | |
| Zymolayse-20T | Sunrise Science Products | N0766391 | For S. cerevisiae |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D-3922 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 137115AM | |
| 1 liter glass bottle | |||
| 250 ml flask | |||
| 2.8 liter flasks | |||
| 2. Yeast lipid droplet isolation | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| Ficoll 400 | Fisher Scientific | BP525 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce Homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge Tubes 25x89mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Fiberlite* F15-6x100y Fixed-Angle Rotor | Thermo-Scientific | 75003698 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| PROTOCOL #2 | |||
| 1. Placental villous cells isolation | |||
| Disposable underpads | Fisher Scientific | 23666062 | |
| Autoclavable pan (container), 3L | Fisher Scientific | 1336110 | |
| Fine scissors, sharp-sharp, straight | Fine science tools | 1406011 | |
| London Forceps | Fine science tools | 1108002 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine science tools | 1127020 | |
| Razor blades | Fisher Scientific | S65921 | |
| Screen cup for CD-1 | Fisher Scientific | S1145 | |
| 40 mesh screen | Fisher Scientific | S0770 | |
| Fisherbrand cell stainers 100μm | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 150 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | NC9054771 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642 | |
| KCl | Fisher Scientific | P333 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P386 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| 2.5% trypsin 10x | Invitrogen | 15090046 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Roche Applied Science | 10104159001 | |
| Sodium bicarbonate solution | Sigma-aldrich | S8761 | |
| 500 ml Erlenmeyer flasks | |||
| 250 ml beakers | |||
| 15 ml centrifuge tubes | |||
| 10 ml serological pipettes | |||
| 50 ml centrifuge tubes | |||
| DMEM | Invitrogen | 11965084 | |
| 2. Lipid droplets isolation from villous placental cells | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220 | |
| Sodium Carbonate | Fisher Scientific | BP357 | |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge tubes 25x89mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| Ultra-Clear centrifuge tubes 14x89mm (for SW41) | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Disposable borosilicate glass pasteur pipets | Fisher Scientific | 1367820C | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biological safety hood | Thermo-Scientific | ||
| Waterbath | Fisher Scientific | ||
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| SW41 Ti Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 331336 | |
| Western blot | |||
| IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG | LI-COR | 926-68071 | dilution 1:15000 |
| IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG | LI-COR | 926-32210 | dilution 1:5000 |
| NuPAGE® Novex® 12% Bis-Tris gels | Invitrogen | NP0341 | |
| primary antibodies for PROTOCOL #1 | |||
| Erg6p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5000 |
| Dpm1p | Abcam | ab113686 | 4 μg/ml |
| Por1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5000 |
| Pma1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:10000 |
| Vma1p (anti-ATP6V1A) | Abcam | ab113745 | 0.5 μg/ml |
| primary antibodies for PROTOCOL #2 | |||
| perilipin 2 (anti-ADFP) | Abcam | ab52355 | 2 μg/ml |
| calnexin | Cell Signaling technology | 2679 | dilution 1:1000 |
| GM130 | Biorbyt | orb40533 | dilution 1:25 |
| COX IV | Cell Signaling technology | 4850 | dilution 1:1000 |
| MEK1 | Biorbyt | orb38775 | dilution 1:50 |
References
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