Marcação retrógrada de células ganglionares da retina em Zebrafish Adulto com corantes fluorescentes

Summary

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Abstract

Rotulagem células ganglionares da retina como retrógrados (RGCs) pode isolar CGR somata de morrer locais, tornou-se o padrão-ouro para a contagem de CGR em CGR sobrevivência e experimentos de regeneração. Muitos estudos têm sido realizados em animais mamíferos para pesquisar CGR sobrevivência após a lesão do nervo óptico. No entanto, a marcação retrógrada de CGR em peixe-zebra adulto ainda não foi relatada, embora alguns métodos alternativos pode contar o número de células em camadas da retina células ganglionares (RGCL). Considerando o pequeno tamanho do crânio adulto zebrafish eo alto risco de morte após a perfuração no crânio, abrimos o crânio com a ajuda de condicionamento ácido e selar o buraco com um vínculo de cura luz, o que pode melhorar significativamente a taxa de sobrevivência. Depois de absorver os corantes, durante 5 dias, quase todos os CGR são rotulados. Como este método não precisa transecto o nervo óptico, é insubstituível na pesquisa de CGR sobrevivência após esmagamento do nervo óptico em peixe-zebra adulto. Aqui, apresentamoseste método passo a passo e fornecer resultados representativos.

Introduction

Como adulto zebrafish tem uma forte capacidade de regenerar os axônios após a lesão do nervo óptico ^1, um método apropriado para contar toda a CGR é essencial para avaliar CGR sobrevivência e regeneração ^2. Baseado nos métodos de CGRs marcação retrógrada em mamíferos e peixes dourados ^3-5, construímos o método para rotular CGRs do tectum em peixes-zebra adultos. Para o adulto zebrafish, duas preocupações técnicos críticos devem ser observados: o crânio de peixe-zebra adulto é muito pequena ^6; eles vivem em um ambiente de água. Aqui, tratamos o crânio com etchant o que minimiza os riscos associados com a perfuração ^5. Em seguida, selar o buraco com vínculo fotoativação que melhora a sobrevida dos animais após a cirurgia.

Anteriormente, foram adotadas diversas outras técnicas para contar o número CGR de forma indireta. Coloração HE nas secções de retina rótulos de todos os tipos de células no RGCL ^7. Marcação de anticorpos em toda a retina, tais como ilhotas-1, também podem marcar células amacrine ^8. Embora rótulo retrógrada do tronco do nervo óptico pode rotular todos os CGR na retina, não pode ser adotado no modelo de esmagamento porque provoca lesão extra para o nervo óptico. Aproveitando-se da etiqueta retrógrada do tectum, temos pesquisado CGR sobrevivência e regeneração no esmagamento do nervo óptico. Os resultados mostram que quase todas as CGRs sobreviveram e mais de 90% das CGR regenerado para o tectum na primeira semana de o modelo de esmagamento do ^9.

Para rotular com sucesso todos os CGR, DII pasta foi escolhido após a comparação com vários outros corantes comerciais ^10. Em primeiro lugar, é especialmente projetado para in vivo rotulagem tecido. Em segundo lugar, é um corante lipofílico que não se pode difundir na água. Além disso, essa fluorescência pode persistir por um longo período de tempo que o torna um excelente candidato para CGR investigação sobrevivência.

Protocol

1. Construir o Aparelho Cirurgia NOTA: Para assegurar o peixe permanece vivo durante e após a operação, a anestesia de gotejamento uma solução de acetato de metanossulfonato de 3-aminobenzoato de metilo (MS-222, ou tricaina) a uma metade da concentração (0,015%), com uma velocidade de 1 gota / seg através da boca do peixe utilizando um sistema de gotejamento homebuilt mostrado na Figura 1. Fazer uma caixa, como mostrado na Figura 1A (compr…

Representative Results

Como Figuras 4B-D mostra, o número de células DII + é de dois terços de células DAPI + em RGCL. Na retina normal, uma imagem de montagem de uma retina inteira (Figura 4E) mostra que DII + CGRs são distribuídos ao longo de toda a retina, mas em uma retina regenerada (Figura 4F), como CGRs na área central não regenerado para o seu alvo em Na primeira semana, eles não poderiam ser rotulados. <p class="jove_content" fo:keep-tog…

Discussion

Marcação retrógrada das CGR é importante para a investigação CGRs sobrevivência em animais mamíferos, mas não tem sido usado em peixes-zebra. Os métodos alternativos, coloração HE ⁷ e coloração de anticorpos ^8, não são padrões de ouro para a contagem número CGR e linhagens transgênicas com todos os CGRs marcadas ainda não foi construído ^{12, 13.} Neste vídeo, apresentamos um método para retrógrado CGR rótulo na retina do peixe-zebra adulto. Apesar de cerca de 1% do…

Materials

MS222	Sigma Aldrich	E10521	USA
DiI	Invitrogen	N22880	USA
lightcuring bond	Heraeus Kulzer	Durafill bond	Germany
Gluma Etch	Heraeus Kulzer	Gluma Etch 35 Gel	Germany
Blue LED	Shenruo Medical Equipment Co.	Power Blue Light Curing Unit	China