Floresan Boyalar Yetişkin Zebra balığı Retina Ganglion Hücreleri retrograd Etiketleme
Summary
We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.
Abstract
Olarak retrograd etiketleme retina ganglion hücrelerinin (RGCs) siteleri ölüyor RGCs somata izole olabilir, bu RGCs hayatta kalma ve rejenerasyon deneylerde RGCs sayma için altın standart haline gelmiştir. Birçok çalışma, optik sinir yaralanmasından sonra RGCs hayatta aratmak için memeli hayvanlarda yapılmıştır. Bazı alternatif yöntemler retina ganglion hücre tabakası (RGCL) hücre sayıları saymak olsa Ancak, yetişkin zebrabalıkları RGCs retrograd etiketleme henüz rapor edilmemiştir. Yetişkin zebrabalıkları kafatasının küçük boyutu ve kafatası üzerinde sondaj sonrası ölüm riski yüksek göz önüne alındığında, biz asit gravür yardımıyla kafatası açık ve önemli ölçüde hayatta kalma oranını getirebileceği bir ışık kür bağ ile delik mühür. 5 gün için boyalar emici sonra, hemen hemen tüm RGCs etiketlenir. Bu yöntem, optik sinir transect gerekmez gibi, yetişkin zebrabalıkları optik sinir ezmek sonra RGCs hayatta araştırma yeri doldurulamaz. Burada, biz tanıtmakBu yöntem, adım adım ve temsili sonuçları sağlar.
Introduction
Yetişkin zebrabalıkları saymak optik sinir hasarı sonrası 1 aksonlar yeniden güçlü bir yeteneği, uygun bir yöntemi var gibi bütün RGCs RGCs yaşam ve yenilenme 2 değerlendirilmesi esastır. Memeli ve akvaryum balığı 3'te retrograd etiketleme RGCs yöntemlere dayalı – 5, biz yetişkin zebrabalıkları TECTUM gelen RGCs etiketlemek yöntemini inşa. Yetişkin Zebra balığı için, iki kritik teknik endişeler dikkat edilmelidir: yetişkin zebrafish kafatası 6 çok küçük; onlar su ortamında yaşıyoruz. Burada, 5 sondaj ile ilişkili tehlikeleri en aza indirir yanığı ile kafatası tedavi. Sonra, biz ameliyattan sonra hayvan yaşamını geliştirir ışık kür bağı ile delik mühür.
Daha önce, diğer bazı teknikler dolaylı yollarla RGCs saymak kabul edildi. HE retina bölümleri boyama RGCL 7 hücrelerinin her türlü etiketler. Bütün r Antikor etiketlemeBöyle adacık-1 gibi etina, ayrıca amacrine hücreleri 8. etiketleyebilirsiniz. Optik sinir güdük retrograd etiket retinada tüm RGCs etiketleyebilirsiniz olsa da optik sinir ekstra yaralanmasına neden olduğundan, bu ezilme modelinde kabul edilemez. TECTUM gelen retrograd etiket yararlanarak, optik sinir ezilme RGCs yaşam ve yenilenme araştırdım. Sonuçlar hemen hemen tüm RGCs hayatta ve RGCs% 90 üzerinde ezilme modelinde 9 ilk hafta TECTUM rejenere olduğunu göstermektedir.
Başarıyla RGCs etiket için, DII macun birçok ticari boyalarda 10 ile karşılaştırılmasından sonra seçildi. İlk olarak, özellikle in vivo doku etiketleme için tasarlanmıştır. İkinci olarak, bu su içinde yaygın olmayan bir lipofilik boyadır. Ayrıca, bu floresan o RGCs hayatta kalma araştırma için mükemmel bir aday yapar uzun süre devam edebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
RGCs retrograd etiketleme memeli hayvanlarda RGCs hayatta araştırma önemlidir, ancak zebrabalıkları kullanılmamıştır. Alternatif yöntemler, HE 7, boyama ve antikor boyama 8, RGCs sayısını saymak için altın standart ve etiketlenmiş tüm RGCs ile transjenik olmayan ama 12, 13, inşa edilmemiştir. Bu videoda, biz yetişkin zebrafish retinada etiket RGCs retrograd bir yöntemi tanıtmak. Akson yaklaşık% 1 koku ampul veya diğer alanların 14 çıkıntı olsa da,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This is supported by 973 MOST grant (Grant No. 2011CB504402, 2012CB947602), National Natural Science Foundation of China (Grant No. 91132724, U1332136) and the ‘Hundred Talents Project’ of Chinese Academy of Science. The protocol was approved by the Committee on the Ethics of Animal Experiments of the USTC (Permit Number: USTCACUC1103013).
Materials
| MS222 | Sigma Aldrich | E10521 | USA |
| DiI | Invitrogen | N22880 | USA |
| lightcuring bond | Heraeus Kulzer | Durafill bond | Germany |
| Gluma Etch | Heraeus Kulzer | Gluma Etch 35 Gel | Germany |
| Blue LED | Shenruo Medical Equipment Co. | Power Blue Light Curing Unit | China |
References
- Wyatt, C., et al. Analysis of the astray/robo2 zebrafish mutant reveals that degenerating tracts do not provide strong guidance cues for regenerating optic axons. J Neurosci. 30, 13838-13849 (2010).
- Grieshaber, P., Lagreze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality. J Neurosci Methods. 192, 233-239 (2010).
- Schwalb, J. M., et al. Two factors secreted by the goldfish optic nerve induce retinal ganglion cells to regenerate axons in culture. J Neurosci. 15, 5514-5525 (1995).
- Watanabe, M., Inukai, N., Fukuda, Y. Survival of retinal ganglion cells after transection of the optic nerve in adult cats: a quantitative study within two weeks. Vis Neurosci. 18, 137-145 (2001).
- Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus. J Vis Exp. , (2008).
- Bakken, T. E., Stevens, C. F. Visual system scaling in teleost fish. J Comp Neurol. 520, 142-153 (2012).
- Zhou, L. X., Wang, Z. R. Changes in number and distribution of retinal ganglion cells after optic nerve crush in zebrafish. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 35, 159-162 (2002).
- Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
- Zou, S., Tian, C., Ge, S., Hu, B. Neurogenesis of retinal ganglion cells is not essential to visual functional recovery after optic nerve injury in adult zebrafish. PLoS One. 8, (2013).
- Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: a comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117, 167-172 (2002).
- Zou, S. Q., et al. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J Vis Exp. , (2010).
- Tokuoka, H., Yoshida, T., Matsuda, N., Mishina, M. Regulation by glycogen synthase kinase-3beta of the arborization field and maturation of retinotectal projection in zebrafish. J Neurosci. 22, 10324-10332 (2002).
- Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection. Development. 132, 2955-2967 (2005).
- Li, L., Dowling, J. E. Disruption of the olfactoretinal centrifugal pathway may relate to the visual system defect in night blindness b mutant zebrafish. Journal of Neuroscience. 20, 1883-1892 (2000).
- Kassing, V., Engelmann, J., Kurtz, R. Monitoring of Single-Cell Responses in the Optic Tectum of Adult Zebrafish with Dextran-Coupled Calcium Dyes Delivered via Local Electroporation. PLoS One. 8, (2013).
