תיוג מדרדר של תאים ברשתית גנגליון מבוגרים דג הזברה עם צבעי ניאון
Summary
We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.
Abstract
תאים כמדרדרים תיוג רשתית גנגליון (RGCs) יכולים לבודד somata RGCs ממוות באתרים, זה הפך להיות תקן הזהב לספירת RGCs בהישרדות RGCs וניסויים התחדשות. מחקרים רבים שבוצעו בבעלי חיים יונקים, כדי לחקור הישרדות RGCs לאחר פציעת עצב ראייה. עם זאת, תיוג מדרדר של RGCs בדג זברה מבוגר עדיין לא דיווח, אם כי יכולות כמה שיטות חלופיות לספור מספרי תא בשכבות רשתית גנגליון תא (RGCL). בהתחשב בגודל הקטן של גולגולת דג הזברה המבוגר והסיכון הגבוה למוות לאחר הקידוח בגולגולת, אנחנו פותחים את הגולגולת בעזרת חומצת תחריט ולאטום את החור עם קשר ריפוי אור, אשר באופן משמעותי יכול לשפר את שיעור ההישרדות. לאחר ספיגת הצבעים במשך 5 ימים, כמעט כל RGCs מסומנים. כמו בשיטה זו לא צריכה transect עצב הראייה, שהוא אין לו תחליף במחקר של הישרדות RGCs לאחר למחוץ עצב ראייה בדג זברה מבוגר. הנה, אנחנו מציגיםצעד אחר צעד בשיטה זו ולספק תוצאות נציג.
Introduction
כמו שיש לי דג הזברה מבוגר יכולת חזקה כדי להתחדש אקסונים לאחר פציעת עצב הראייה 1, שיטה נכונה כדי לספור את כל RGCs הוא חיוני כדי להעריך הישרדות RGCs והתחדשות 2. בהתבסס על השיטות של RGCs תיוג המדרדר ב3 יונקים ודגי זהב – 5, בנינו השיטה לתייג RGCs מtectum בדג זברה מבוגר. לדג זברה מבוגר, יש לציין שתי בעיות טכניות קריטיות: הגולגולת של דג הזברה מבוגר היא קטנה מאוד 6; הם חיים בסביבת מים. כאן, אנו מטפלים בגולגולת עם etchant אשר ממזערת את הסיכונים הקשורים לקידוח 5. לאחר מכן, אנו לאטום את החור עם קשר ריפוי אור אשר משפר את סיכויי ההישרדות של בעלי חיים לאחר ניתוח.
בעבר, כמה טכניקות אחרות אומצו לספור מספר RGCs בדרכים עקיפות. הוא מכתים בסעיפי רשתית תוויות לכל סוגי תאים ב7 RGCL. תיוג נוגדן בכל retina, כגון איון-1, יכול גם לתייג תאי amacrine 8. למרות תווית מדרדר מגדם עצב הראייה יכולה לתייג כל RGCs ברשתית, זה לא יכול להיות מאומץ במודל ההתאהבות משום שהיא גורמת לפגיעה נוספת לעצב הראייה. ניצול של תווית מדרדר מtectum, יש לנו חקר הישרדות RGCs והתחדשות בדוחק עצב ראייה. תוצאות מראות כי כמעט כל RGCs שרד ומעל 90% מRGCs מחדש לtectum בשבוע הראשון במודל ההתאהבות 9.
כדי לתייג בהצלחה את כל RGCs, רסק DiI נבחר לאחר השוואה עם מספר צבעים מסחריים אחרים 10. ראשית, הוא נועד בעיקר לתיוג רקמות בגוף החי. שנית, זה צבע lipophilic שלא ניתן לנטרל במים. בנוסף, הקרינה זו יכולה להימשך זמן רב מה שהופך אותו למועמד מצוין למחקר הישרדות RGCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
תיוג מדרדר של RGCs חשוב לחקור הישרדות RGCs בבעלי חיים יונקים, אבל זה לא נעשה שימוש בדג זברה. השיטות חלופיות, הוא מכתים 7 ומכתים נוגדן 8, אינם סטנדרטים זהב לספירת מספר RGCs, וקווים מהונדסים עם כל RGCs כותרת טרם נבנו 12, 13. בסרטון הזה, אנו מציגים שיטת מדרדר RGCs תווית …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This is supported by 973 MOST grant (Grant No. 2011CB504402, 2012CB947602), National Natural Science Foundation of China (Grant No. 91132724, U1332136) and the ‘Hundred Talents Project’ of Chinese Academy of Science. The protocol was approved by the Committee on the Ethics of Animal Experiments of the USTC (Permit Number: USTCACUC1103013).
Materials
| MS222 | Sigma Aldrich | E10521 | USA |
| DiI | Invitrogen | N22880 | USA |
| lightcuring bond | Heraeus Kulzer | Durafill bond | Germany |
| Gluma Etch | Heraeus Kulzer | Gluma Etch 35 Gel | Germany |
| Blue LED | Shenruo Medical Equipment Co. | Power Blue Light Curing Unit | China |
References
- Wyatt, C., et al. Analysis of the astray/robo2 zebrafish mutant reveals that degenerating tracts do not provide strong guidance cues for regenerating optic axons. J Neurosci. 30, 13838-13849 (2010).
- Grieshaber, P., Lagreze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality. J Neurosci Methods. 192, 233-239 (2010).
- Schwalb, J. M., et al. Two factors secreted by the goldfish optic nerve induce retinal ganglion cells to regenerate axons in culture. J Neurosci. 15, 5514-5525 (1995).
- Watanabe, M., Inukai, N., Fukuda, Y. Survival of retinal ganglion cells after transection of the optic nerve in adult cats: a quantitative study within two weeks. Vis Neurosci. 18, 137-145 (2001).
- Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus. J Vis Exp. , (2008).
- Bakken, T. E., Stevens, C. F. Visual system scaling in teleost fish. J Comp Neurol. 520, 142-153 (2012).
- Zhou, L. X., Wang, Z. R. Changes in number and distribution of retinal ganglion cells after optic nerve crush in zebrafish. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 35, 159-162 (2002).
- Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
- Zou, S., Tian, C., Ge, S., Hu, B. Neurogenesis of retinal ganglion cells is not essential to visual functional recovery after optic nerve injury in adult zebrafish. PLoS One. 8, (2013).
- Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: a comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117, 167-172 (2002).
- Zou, S. Q., et al. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J Vis Exp. , (2010).
- Tokuoka, H., Yoshida, T., Matsuda, N., Mishina, M. Regulation by glycogen synthase kinase-3beta of the arborization field and maturation of retinotectal projection in zebrafish. J Neurosci. 22, 10324-10332 (2002).
- Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection. Development. 132, 2955-2967 (2005).
- Li, L., Dowling, J. E. Disruption of the olfactoretinal centrifugal pathway may relate to the visual system defect in night blindness b mutant zebrafish. Journal of Neuroscience. 20, 1883-1892 (2000).
- Kassing, V., Engelmann, J., Kurtz, R. Monitoring of Single-Cell Responses in the Optic Tectum of Adult Zebrafish with Dextran-Coupled Calcium Dyes Delivered via Local Electroporation. PLoS One. 8, (2013).
