Marquage rétrograde des cellules ganglionnaires de la rétine à l'âge adulte de poisson zèbre avec des colorants fluorescents

Summary

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Abstract

Cellules rétrogrades en matière d'étiquetage de la rétine ganglionnaires (CGR) peuvent isoler CGR soma de mourir sites, il est devenu l'étalon-or pour compter CGR dans la survie CGR et des expériences de régénération. De nombreuses études ont été réalisées chez les animaux mammifères à la recherche survie CGR après une blessure du nerf optique. Cependant, marquage rétrograde de RGC chez le poisson zèbre adulte n'a pas encore été signalé, bien que certaines méthodes peuvent compter le nombre de cellules en couches de cellules ganglionnaires de la rétine (RGCL). Compte tenu de la petite taille du crâne de poisson zèbre adulte et le risque élevé de décès après le forage sur le crâne, nous ouvrons le crâne à l'aide de gravure à l'acide et sceller le trou avec un lien de photopolymérisation, ce qui pourrait améliorer de manière significative le taux de survie. Après avoir absorbé les colorants pendant 5 jours, presque tous les CGR sont étiquetés. Comme cette méthode n'a pas besoin de sectionner le nerf optique, il est irremplaçable dans la recherche de la survie CGR après écrasement du nerf optique chez le poisson zèbre adulte. Ici, nous introduisonsce procédé étape par étape et de fournir des résultats représentatifs.

Introduction

Comme le poisson zèbre adulte a une forte capacité à régénérer les axones après une blessure du nerf optique ^1, une méthode appropriée de compter l'ensemble CGR est essentiel d'évaluer la survie et la régénération CGR ^2. Basé sur les méthodes de CGR en matière d'étiquetage rétrogrades dans les mammifères et les poissons rouges ^{3 – 5,} nous avons construit la méthode d'étiqueter CGR du tectum chez le poisson zèbre adulte. Pour le poisson zèbre adulte, deux problèmes techniques critiques doivent être notées: le crâne de poisson zèbre adulte est très faible ^6; ils vivent dans un environnement d'eau. Ici, nous traitons le crâne avec gravure qui minimise les risques associés au forage ^5. Ensuite, nous fermons le trou avec liaison photopolymérisation qui améliore la survie des animaux après la chirurgie.

Auparavant, plusieurs autres techniques ont été adoptées à compter le nombre CGR de façon indirecte. Coloration HE dans les sections de la rétine étiquettes tous les types de cellules dans le RGCL ^7. marquage de l'anticorps dans l'ensemble retina, comme îlot-1, peut aussi marquer les cellules amacrines ^8. Bien que l'étiquette rétrograde du nerf optique peut souche étiqueter tous les CGR de la rétine, il ne peut être adopté dans le modèle de l'écrasement car elle cause un préjudice supplémentaire pour le nerf optique. Profitant de l'étiquette rétrograde du tectum, nous avons déniché survie CGR et la régénération du nerf optique dans l'écrasement. Les résultats montrent que presque tous les CGR survécu et plus de 90% des CGR régénérés au tectum lors de la première semaine dans le modèle d'écrasement ^9.

Dans le but d'étiqueter correctement les CGR, Dil pâte a été choisi après comparaison avec plusieurs autres colorants commerciaux ^10. Tout d'abord, il est spécialement conçu pour le marquage in vivo de tissus. D'autre part, il s'agit d'un colorant lipophile qui ne peut pas se diffuser dans l'eau. En outre, cette fluorescence peut persister pendant une longue période qui en fait un excellent candidat pour la recherche de la survie CGR.

Protocol

1. Construire l'Appareil de chirurgie REMARQUE: Pour assurer le poisson reste en vie pendant et après l'opération, goutte à goutte anesthésie solution éthyle méthanesulfonate 3 benzoate (MS-222, ou Tricaine) à une demi-concentration (0,015%) avec une vitesse de 1 goutte / sec par la bouche du poisson en utilisant un système de goutte à goutte homebuilt représenté sur la figure 1. Faire une boîte comme indiqué sur la figure 1A …

Representative Results

Comme les figures 4B-D spectacle, le nombre de cellules DiI + est de deux tiers des DAPI + cellules RGCL. Dans une rétine normale, une image de montage de l'ensemble de la rétine (figure 4E) montre que DiI + CGR sont répartis sur toute la rétine, mais dans une rétine régénérée (figure 4F), comme CGR dans la zone centrale n'ont pas régénéré à leur cible à la première semaine, ils ne pouvaient pas être étiquetés….

Discussion

Marquage rétrograde de RGC est important de rechercher la survie CGR chez les animaux mammifères, mais il n'a pas été utilisée dans le poisson-zèbre. Les méthodes alternatives, coloration HE ⁷ et la coloration des anticorps ^8, ne sont pas des normes de référence pour compter le nombre CGR, et les lignées transgéniques avec tous les CGR marquées n'a pas encore été construit ^{12, 13.} Dans cette vidéo, nous introduisons une méthode de rétrograder CGR d'étiquette…

Materials

MS222	Sigma Aldrich	E10521	USA
DiI	Invitrogen	N22880	USA
lightcuring bond	Heraeus Kulzer	Durafill bond	Germany
Gluma Etch	Heraeus Kulzer	Gluma Etch 35 Gel	Germany
Blue LED	Shenruo Medical Equipment Co.	Power Blue Light Curing Unit	China