Retrograd Märkning av retinal ganglion celler i vuxna zebrafisk med fluorescerande färger
Summary
We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.
Abstract
Som bakåtsträvande märkning retinal ganglion celler (RGC) kan isolera RGC somata från att dö platser, har det blivit den gyllene standarden för att räkna RGC i RGC överlevnad och regenereringsexperiment. Många studier har utförts på däggdjur till forskning RGC överlevnad efter synnerven skada. Emellertid retrograd märkning av RGC i vuxna zebrafisk har ännu inte rapporterats, även om vissa alternativa metoder kan räkna cellantal i retinala ganglioncellskikt (RGCL). Med tanke på den begränsade storleken på den vuxna zebrafisk skallen och den stora risken för död efter borrning på skallen, öppnar vi skallen med hjälp av syraetsning och täta hålet med en ljushärdning obligation, som avsevärt skulle kunna förbättra överlevnaden. Efter att absorbera färgämnen i 5 dagar, har nästan alla RGC märkta. Eftersom denna metod inte behöver för tvärsnitt av synnerven, det är oersättlig i forskningen av RGC överlevnad efter synnerven krossa i vuxen zebrafisk. Här presenterar vimetoden steg för steg och ger representativa resultat.
Introduction
Som vuxen zebrafisk har en stark förmåga att regenerera axoner efter synnerven skada 1, en lämplig metod för att räkna hela RGC är viktigt att utvärdera RGC överlevnad och regeneration 2. Baserat på de metoder för bakåtsträvande märkning RGC i däggdjurs-och guldfiskar 3-5, konstruerade vi den metod för att märka RGC: er från tectum i vuxen zebrafisk. För vuxna zebrafisk, bör två viktiga tekniska problem noteras: skallen av vuxna zebrafisk är mycket liten 6; de lever i en vattenmiljö. Här behandlar vi skallen med etsningsmedel som minimerar riskerna i samband med borrning 5. Sedan vi täta hålet med ljushärdning obligation som förbättrar djurens överlevnad efter operation.
Tidigare har flera andra metoder som antagits för att räkna RGC nummer i indirekta sätt. HE-färgning i näthinnan sektioner etiketter alla typer av celler i RGCL 7. Antikropps märkning i hela retina såsom islet-1, kan också märka amakrina celler 8. Även retrograd etikett från synnerven stubben kan märka alla RGC i näthinnan, kan det inte antas i trängseln modellen eftersom det orsakar extra skada på synnerven. Med utnyttjande av retrograd etikett från tectum, har vi undersökt RGC överlevnad och regeneration i synnerven krossa. Resultaten visar att nästan alla RGC överlevt och över 90% av RGC regener till tectum vid den första veckan i krossmodellen 9.
För att framgångsrikt kunna märka alla RGC var Dil pasta valt efter jämförelse med ett antal andra kommersiella färgämnen 10. För det första är det speciellt konstruerad för in vivo vävnad märkning. Det andra är det ett lipofilt färgämne, som inte kan diffundera i vatten. Dessutom kan denna fluorescens kvarstå under en lång tid, vilket gör den till en utmärkt kandidat för RGC överlevnad forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Retrograd märkning av RGC är viktigt att forska RGC överlevnad i däggdjur, men det har inte använts i zebrafisk. De alternativa metoder, HE-färgning 7 och antikroppsfärgning 8, är inte guld-standarder för räkning av RGC antal och transgena linjer med alla RGC märkta ännu inte har konstruerats 12, 13. I denna video presenterar vi en metod för att retrograd etikett RGC: er i näthinnan av vuxna zebrafisk. Även om ca 1% av axoner projicera att luktloben eller andra områden <s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This is supported by 973 MOST grant (Grant No. 2011CB504402, 2012CB947602), National Natural Science Foundation of China (Grant No. 91132724, U1332136) and the ‘Hundred Talents Project’ of Chinese Academy of Science. The protocol was approved by the Committee on the Ethics of Animal Experiments of the USTC (Permit Number: USTCACUC1103013).
Materials
| MS222 | Sigma Aldrich | E10521 | USA |
| DiI | Invitrogen | N22880 | USA |
| lightcuring bond | Heraeus Kulzer | Durafill bond | Germany |
| Gluma Etch | Heraeus Kulzer | Gluma Etch 35 Gel | Germany |
| Blue LED | Shenruo Medical Equipment Co. | Power Blue Light Curing Unit | China |
References
- Wyatt, C., et al. Analysis of the astray/robo2 zebrafish mutant reveals that degenerating tracts do not provide strong guidance cues for regenerating optic axons. J Neurosci. 30, 13838-13849 (2010).
- Grieshaber, P., Lagreze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality. J Neurosci Methods. 192, 233-239 (2010).
- Schwalb, J. M., et al. Two factors secreted by the goldfish optic nerve induce retinal ganglion cells to regenerate axons in culture. J Neurosci. 15, 5514-5525 (1995).
- Watanabe, M., Inukai, N., Fukuda, Y. Survival of retinal ganglion cells after transection of the optic nerve in adult cats: a quantitative study within two weeks. Vis Neurosci. 18, 137-145 (2001).
- Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus. J Vis Exp. , (2008).
- Bakken, T. E., Stevens, C. F. Visual system scaling in teleost fish. J Comp Neurol. 520, 142-153 (2012).
- Zhou, L. X., Wang, Z. R. Changes in number and distribution of retinal ganglion cells after optic nerve crush in zebrafish. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 35, 159-162 (2002).
- Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
- Zou, S., Tian, C., Ge, S., Hu, B. Neurogenesis of retinal ganglion cells is not essential to visual functional recovery after optic nerve injury in adult zebrafish. PLoS One. 8, (2013).
- Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: a comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117, 167-172 (2002).
- Zou, S. Q., et al. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J Vis Exp. , (2010).
- Tokuoka, H., Yoshida, T., Matsuda, N., Mishina, M. Regulation by glycogen synthase kinase-3beta of the arborization field and maturation of retinotectal projection in zebrafish. J Neurosci. 22, 10324-10332 (2002).
- Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection. Development. 132, 2955-2967 (2005).
- Li, L., Dowling, J. E. Disruption of the olfactoretinal centrifugal pathway may relate to the visual system defect in night blindness b mutant zebrafish. Journal of Neuroscience. 20, 1883-1892 (2000).
- Kassing, V., Engelmann, J., Kurtz, R. Monitoring of Single-Cell Responses in the Optic Tectum of Adult Zebrafish with Dextran-Coupled Calcium Dyes Delivered via Local Electroporation. PLoS One. 8, (2013).
