المجهر الضوئي الكمية: قياس الخلوية البيوفيزيائية الميزات مع مجهر بصري قياسي
Summary
We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.
Abstract
وصفنا استخدام المجهر الضوئي القياسية لأداء القياسات الكمية من الكتلة والحجم، والكثافة على العينات الخلوية من خلال مزيج من حقل مشرق والتفضيلية تدخل على النقيض الصور. يتم عرض نهجين أساسيين: noninterferometric المرحلة الكمي المجهري (NIQPM)، لأداء القياسات من مجموع كتلة الخلية وتوزيع الكثافة التحت خلوية، وهيلبرت تحويل التدخل النقيض التفاضلية المجهري (HTDIC) لتحديد حجم. ويستند NIQPM على نموذج مبسط لانتشار الموجات، ووصف تقريب مجاور للمحور، مع ثلاثة الافتراضات الأساسية: منخفض الفتحة العددية (NA) الإضاءة، ضعيفة نثر، وامتصاص ضعيفة الضوء من العينة. لحسن الحظ، والعينات الخلوية غير ملوثين تلبية هذه الافتراضات ويتحقق انخفاض NA الإضاءة بسهولة على المجاهر التجارية. يستخدم HTDIC للحصول على معلومات الحجمي من صور مدينة دبي للإنترنت من خلال التركيز تحت عالية NA illuminشروط أوجه. NA إضاءة عالية تمكن تعزيز باجتزاء من العينة على طول المحور البصري. هيلبرت تحويل المعالجة على الصورة DIC مداخن بشكل كبير يعزز حافة خوارزميات الكشف عن توطين حدود العينة في ثلاثة أبعاد من خلال فصل القيم الرمادية من كثافة عينة من تلك الخلفية. المزايا الأساسية لNIQPM وHTDIC يكمن في الوصول التكنولوجية الخاصة بهم باستخدام المجاهر "قبالة الجاهزة للاستخدام". هناك نوعان من القيود الأساسية من هذه الأساليب: بطيئة ض المكدس اكتساب الوقت على نطاقات التجارية يلغي حاليا التحقيق في الظواهر أسرع من الإطار 1 / دقيقة، وثانيا، والآثار الحيود تقييد فائدة NIQPM وHTDIC إلى كائنات من 0.2 إلى 10 (NIQPM) و 20 (HTDIC) ميكرون في القطر، على التوالي. وبالتالي، يجب على عينة والوقت المرتبط به ديناميات الفائدة تلبية حجم معين والقيود الزمنية لتمكين استخدام هذه الأساليب. والمثير أن معظم cellula الثابتةيتم التحقيق العينات ص بسهولة مع هذه الطرق.
Introduction
استخدام المجهر الضوئي هو الآن في كل مكان في التحقيق في الكائنات الحية الخلوية. وترجع الزيادة إلى انخفاض الذاتية الامتصاصية وضعف نثر خصائص الطيف الضوئي على مدى مرئية، والخلايا لا تؤثر بشدة اتساع الموجات الضوئية التي تعبر منها، ويبدو شبه شفاف عندما التقط مع المجاهر حقل مشرق القياسية الآن. العينات الخلوية لا، ومع ذلك، وإبطاء موجات الضوئية السفر من خلالهم بطريقة يرتبط خطيا لكمية من كثافة الإعلام المحلية في منطقة معينة من الفضاء من خلالها الضوء يسافر. وكان أول وصف استخدام هذا الفارق الزمني غير متجانسة أو "مرحلة" لمحة من موجات الضوئية التي تنتقل عن طريق عينات مجهرية في عام 1935 من قبل فريتس Zernike 1 وأدركت تجريبيا بواسطة Zernikein 1942 2. منحت جائزة نوبل Zernike في عام 1953 لتحقيق هذا الإنجاز. زايس تجاريا هذه الطريقة في عام 1945 3. في عام 1955، سميث وNomarskوأود أن تقديم العمل الأولي على استخدام 4 و 5 من نظرية النقيض تدخل الفرق (DIC) المجهري، وهو أسلوب يستخدم التدرج المكاني للمرحلة كآلية التباين. تم تسويقها من قبل مدينة دبي للإنترنت زايس في 1965in بالتعاون الوثيق مع Nomarski 6. في عام 1981، أثبتت مختبرين سجلت أول الخلية الحية DIC الصور مع إدماج كاميرات الفيديو في القطار البصريات المجهر DIC 7، 8. ولدت في عصر التصوير الخلية الحية.
منذ هذا الوقت، وكان إعدام كل من النقيض المرحلة ومدينة دبي للإنترنت على المجاهر التجارية إلى حد كبير دون تغيير. وتستخدم هذه الطرق أساسا من قبل علماء الأحياء لإنتاج صور من الخلايا لأغراض النوعي: رصد التشكل، وتتبع هياكل التحت خلوية، والتحقيق في ديناميات غشاء 9. هذه التقنيات هي النوعية في التكوين الخاصة بهم "الجاهزة" على حد سواء المرحلة وDIالصور C هي وظائف التعسفي من شدة مصدر الضوء، وإعدادات البصريات والإضاءة، وكسب كاميرا CCD، غاما، وإعدادات التعرض.
وقد سعت والفيلق صغيرة من الفيزيائيين والمهندسين البصرية لجعل طرائق التصوير التجاري الكمي. بين الجهود الأولى كانت رسالتين إلى الطبيعة في عام 1952 و 1953 التي الطبيب الذي تحول إلى الفيزياء الحيوية روبرت تظاهر أكثر عريا استخدام المرحلة المجهر لتحديد كتلة جافة الخلوي للخلايا عن طريق تقدير مرحلة التحولات من خلال هذين النوعين من الخلايا باستخدام المجهر المرحلة المتاحة تجاريا 10، 11. وقد وضعت حقل العديد من التقنيات على مدى السنوات التي تلت ذلك القائمة حول ثلاث آليات النقيض خالية من التسمية الأساسية: مرحلة المجهر 10،11، مدينة دبي للإنترنت المجهر 12-17، وحقل مشرق 18-22 لتحديد مسار بصري طول، المرحلة، الشامل الكثافة، معامل الانكسار، وحجم الخلوية.
في الفقرةllel، كما تم تطوير مجموعة كبيرة من الأجهزة البصرية المخصصة منذ 1950s، وجعلت بعيدة المدى القياسات البصرية التي تتراوح بين التطبيقات في النمو الطفيلي 23، لتوثيق دورة الخلية 24 إلى التحقيق ديناميات غشاء خلايا الدم الحمراء 25. على وجه الخصوص، فقد شهدت السنوات العشر الماضية ثروة من التسمية خالية المجهر الكمي في شكل المرحلة حيود المجهري 26، تصوير الشعاعي الطبقي المرحلة المجهري 27، المجهر الرقمي المجسم 28، مرحلة حساسة التماسك البصري المجهري 29، المكاني تدخل ضوء المجهر 30، هيلبرت المرحلة المجهري 31، والكمية المرحلة المجهري 32. على الرغم من نجاحاتهم الجماعية، لم تنشر هذه الصكوك إلى الحقل أكبر من الباحثين البيولوجية بسبب، في الغالب، إلى الأجهزة الخاصة بهم المعقدة والمتطلبات الحاسوبية.
نحن هنا دescribe استخدام المجهر الضوئي القياسية لأداء القياسات الكمية للكتلة، وحجم، وكثافة على العينات الخلوية من خلال مزيج من حقل مشرق وصور مدينة دبي للإنترنت. يتم عرض نهجين أساسيين: noninterferometric المرحلة الكمي المجهري (NIQPM)، لأداء القياسات من مجموع كتلة الخلية وتوزيع الكثافة التحت خلوية، وهيلبرت تحويل التدخل النقيض التفاضلية المجهري (HTDIC)، لتحديد حجم. المزايا الأساسية لNIQPM وHTDIC يكمن في الوصول التكنولوجية. الشروط التصوير اللازمة لتنفيذها الناجحة هي ضمن نطاق العمل العادي لمعظم المجاهر متاحة تجاريا. بالإضافة إلى ذلك، خوارزميات مرحلة ما بعد المعالجة مستقرة، وسريعة، وقوية – بعد أن تم تنفيذها في MATLAB باستخدام تحويل فورييه السريع الخوارزميات (الاتحاد الفرنسي للتنس) استنادا كلما أمكن ذلك.
NIQPM هي طريقة لإعادة المرحلة وكثافة كتلة متكاملة محوريا من سلعينات من الصور lular حقل مشرق. محصلة هذه الكثافة كتلة متكاملة محوريا فوق منطقة العينة يعطي مجموع المحتوى الشامل الجافة للعينة. ويستند البروتوكول NIQPM على الأسس التجريبية التي وضعتها Paganin ونوجنت 18، 19 – الذي أثبت أن الملف الشخصى المرحلة من خلية يمكن بناؤها من الصور مجال مشرق من خلال تركيز العينة – والعمل النظري من فرانك ، Altmeyer، وفيرنيك 20 – على حل نماذج موجة مجاور للمحور بطريقة فعالة تستند الاتحاد الفرنسي للتنس. ويستند اتصال من مرحلة إلى كثافة الكتلة الجافة على العمل من قبل أكثر عريا 10 و 11 و 33 بوبيسكو.
يمكن الحصول على معلومات الحجمي من مدينة دبي للإنترنت من خلال صور عالية التركيز تحت ظروف الإضاءة NA التي تمكن باجتزاء البصرية من العينة على طول المحور البصري. هيلبرت تحويل المعالجة على مداخن صورة مدينة دبي للإنترنت يعزز إلى حد كبيرخوارزميات الكشف عن الحافة لتوطين حدود العينة في ثلاثة أبعاد من خلال فصل القيم الرمادية من كثافة عينة من تلك الخلفية. هذا العمل ينبع مع Arinson وآخرون 34 على الرغم من أننا قد أدخلت كل من طرق تصفية فورييه لتعزيز التباين وحافة طريقة الكشف يستند سوبل للتحليل الحجمي الآلي من العينة. لدينا أيضا التحقق من صحة HTDIC سابقا على المجالات البوليسترين تتراوح في حجمها من الحد الحيود تصل إلى 20 ميكرون في القطر 36.
في حين أن كلا NIQPM وHTDIC يمكن الوصول إليها من الناحية التكنولوجية نظرا لتطورها على المجاهر التجارية، والأساليب تقتصر بشكل أساسي من تكوين الأجهزة من المجاهر أنفسهم. قيود الرئيسي من هذه التقنيات هي ذات شقين: بطيئة ض المكدس اكتساب الوقت على نطاقات التجارية، وذلك بسبب ترجمة المرحلة عينة بأكملها بدلا من مجرد عدسة الهدف، يحد حاليا التحقيق في الظواهر أسرع من ما يقرب من 1 الإطار / دقيقة، وثانيا، والآثار الحيود تقييد فائدة NIQPM وHTDIC إلى كائنات تتراوح في حجمها من 0.2 إلى 10 و 20 ميكرون في القطر، على التوالي. وبالتالي، فإن العينة وديناميات الوقت يرتبط به من الفائدة يجب أن تفي حجم معين والقيود الزمنية لتمكين استخدام هذه الأساليب على صكوك نموذجية "قبالة الجاهزة للاستخدام". والمثير أن يتم التحقيق في معظم العينات الخلوية الثابتة بسهولة مع هذه الطرق.
يتم إعطاء لمحة عامة عن NIQPM والبروتوكولات HTDIC في الشكل 1. في الشكل 2 نحن لتوضيح التصوير الأمثل والأمثل من خلال التركيز على حد سواء في ظل ظروف الإضاءة المنخفضة والعالية على حد سواء NA حقل مشرق وصور مدينة دبي للإنترنت. أرقام 3 و 4 تدليل على الاعتماد المعلمة من الخوارزمية NIQPM تسليط الضوء على تطبيقات الناجحة وغير الناجحة. <strong> ويوضح الشكل (5) والخطوات المتبعة في الخوارزمية لمعالجة الصور HTDIC ويدل على التنفيذ الأمثل لخوارزمية لتحديد حجم الخلوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
بشكل عام، NIQPM هي تقنية محدودة الحيود على التحقق من صحة مسار بصري أطوال تتراوح ،25-44،7. تم إجراء التحقق من الصحة على ن = 1.596 المجالات البوليسترين تتراوح في القطر ،11-9،8 ميكرون معلقة في Fluoromount G (لا تظهر البيانات). تمتلك الخلايا الضوئية أطوال الطريق التي تتراوح بين ما يقرب من 0…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (U54CA143906 لKGP، OJTM وR01HL101972 لOJTM) ومؤسسة أبحاث أوريغون الطبية جائزة الباحث السريرية المبكرة (KGP). OJTM هو محقق جمعية القلب الأمريكية تأسست (13EIA12630000). نشكر الدكتور اريك اندرسون من معهد السرطان فارس لإعداد عينات الخلايا المستخدمة في هذا العمل.
Materials
| Zeiss Axio Imager 2 microscope | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | Axio Imager D2 | Microscope |
| Green filter (λ = 540 ± 25 nm) | Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont | D540/25x | Green filter |
| SlideBook 5.5 software | Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado | Image acquistion software | |
| Polystyrene microspheres | Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN | PS06N | Polystyrene spheres |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, Alabama | 0100-01 | Mounting media |
References
- Zernike, F. Das Phasenkontrastverfahren bei der mikroskopischen Beobachtung. Z. Technische Physik. 16, 454-457 (1935).
- Zernike, F. Phase contrast, a new method for the microscopic observation of transparent objects. Physica. 9 (42), 974-986 (1942).
- Blow, N. Finding Phase. Nat. Cell Biol. 11, (2009).
- Smith, F. H. . Microscopic interferometry, Research. 8, 385-395 (1955).
- Nomarski, G. Microinterféromètre différentiel à ondes polarisées. J. Phys. Radium. 16, (1955).
- Lang, W. Nomarski differential-interference contrast microscopy. Zeiss Inform. 70, 114-120 (1968).
- Allen, R. D., Allen, N. S., Travis, J. L. Video-enhanced contrast, differential interference contrast (VEC-DIC) microscopy: a new method capable of analyzing microtubule-related motility in the reticulopodial network of Allogromia laticollaris. Cell Motil. Cytoskel. 1, 291-302 (1981).
- Inoué, S. Video image processing greatly enhances contrast, quality, and speed in polarization-based microscopy. J. Cell Biol. 89, 346-356 (1981).
- Aslan, J. E., Itakura, A., Gertz, J. M., McCarty, O. J. Platelet shape change and spreading. Methods Mol. Biol. , 10-1007 (2012).
- Barer, R. Interference microscopy and mass determination. Nature. 169, 366-367 (1038).
- Ross Barer, R., Tkaczyk, K. F. A., S, Refractometry of living cells. Nature. 171, 720-724 (1953).
- Preza, C., Snyder, D. L., Conchello, J. A. Theoretical development and experimental evaluation of imaging models for differential interference contrast microscopy. J. Opt. Soc. Am. A. 16, 2185-2199 (1999).
- Arnison, M. R., Larkin, K. G., Sheppard, C. J., Smith, N. I., Cogswell, C. J. Linear phase imaging using differential interference contrast microscopy. J. Microsc. 214, 7-12 (2004).
- Van Munster, E. B., Van Vliet, L. J., Aten, J. A. Reconstruction of optical pathlength distributions from images obtained by a wide‐field differential interference contrast microscope. J. Microsc. 188, 149-157 (1997).
- Kou, S. S., Waller, L., Barbastathis, G., Sheppard, C. J. Transport-of-intensity approach to differential interference contrast (TI-DIC) microscopy for quantitative phase imaging. Opt. Lett. 35, 447-449 (2010).
- Xu, M. Scattering-phase theorem: anomalous diffraction by forward-peaked scattering media. Opt. Exp. 19, 21643-21651 (2011).
- Duncan, D. D., Fischer, D. G., Dayton, A., Prahl, S. A. Quantitative Carré differential interference contrast microscopy to assess phase and amplitude. J. Opt. Soc. Am. A. 28, 1297-1306 (2011).
- Barty, A., Nugent, K. A., Paganin, D., Roberts, A. Quantitative optical phase microscopy. Opt. Lett. 23, 817-819 (1998).
- Paganin, D., Nugent, K. A. Non-interferometric phase imaging with partially coherent light. Phys. Rev. Lett. 80, 2586-2589 (1998).
- Frank, J., Altmeyer, S., Wernicke, G. N. o. n. -. i. n. t. e. r. f. e. r. o. m. e. t. r. i. c. non-iterative phase retrieval by Green’s functions. J. Opt. Soc. Am. A. 27, 2244-2251 (2010).
- Phillips, K. G., Velasco, C. R., Li, J., Kolatkar, A., Luttgen, M., Bethel, K., Duggan, B., Kuhn, P., McCarty, O. J. Optical quantification of cellular mass, volume, and density of circulating tumor cells identified in an ovarian cancer patient. Front. Oncol. 2, 1-8 (2012).
- Phillips, K. G., Jacques, S. L., McCarty, O. J. Measurement of single cell refractive index, dry mass, volume, and density using a transillumination microscope. Phys. Rev. Lett. 109, 1-5 (2012).
- Park, Y. K., Diez-Silva, M., Popescu, G., Lykotrafitis, G., Choi, W., Feld, M. S., Suresh, S. Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum. , 105-13730 (2008).
- Mir, M., Wang, Z., Shen, Z., Bednarz, M., Bashir, R., Golding, I., Popescu, G. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13124-13129 (2011).
- Popescu, G., Ikeda, T., Goda, K., Best-Popescu, C. A., Laposata, M., Manley, S., Feld, M. S. Optical measurement of cell membrane tension. Phys. Rev. Lett. 97, 1-4 (2006).
- Popescu, G., Ikeda, T., Dasari, R. R., Feld, M. S. Diffraction phase microscopy for quantifying cell structure and dynamics. Opt. Lett. 31, 775-777 (2006).
- Choi, W., Fang-Yen, C., Badizadegan, K., Oh, S., Lue, N., Dasari, R. R., Feld, M. S. Tomographic phase microscopy. Nat. Methods. 4 (9), 717-719 (2007).
- Charrière, F., Marian, A., Montfort, F., Kuehn, J., Colomb, T., Cuche, E., Depeursinge, C. Cell refractive index tomography by digital holographic microscopy. Opt. Lett. 31, 178-180 (2006).
- Joo, C., Akkin, T., Cense, B., Park, B. H., de Boer, J. F. Spectral-domain optical coherence phase microscopy for quantitative phase-contrast imaging. Opt. Lett. 30, 2131-2133 (2005).
- Wang, Z., Millet, L., Mir, M., Ding, H., Unarunotai, S., Rogers, J., Popescu, G. Spatial light interference microscopy. SLIM). Opt. Exp. 19, 1016-1026 (2011).
- Ikeda, T., Popescu, G., Dasari, R. R., Feld, M. S. Hilbert phase microscopy for investigating fast dynamics in transparent systems. Opt. Lett. 30, 1165-1167 (2005).
- Shaked, N. T., Rinehart, M. T., Wax, A. Dual-interference-channel quantitative-phase microscopy of live cell dynamics. Opt. Lett. 34, 767-769 (2009).
- Popescu, G., Park, Y., Lue, N., Best-Popescu, C., Deflores, L., Dasari, R. R., Badizadegan, K. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 295, (2008).
- Arnison, M. R., Cogswell, C. J., Smith, N. I., Fekete, P. W., Larkin, K. G. Using the Hilbert transform for 3D visualization of differential interference contrast microscope images. J. Microsc. 199, 79-84 (2001).
- Baker, S. M., Phillips, K. G., McCarty, O. J. Development of a label-free imaging technique for the quantification of thrombus formation. Cell. Mol. Bioeng. 5, 488-492 (2012).
